红细胞膜蛋白提取流程

1、 红细胞膜蛋白提取鉴定红细胞膜蛋白提取鉴定内容内容 1. 红细胞膜提取红细胞膜提取 2. 膜蛋白提取及定量测定（膜蛋白提取及定量测定（lowry法）法） 3.膜蛋白电泳分离、分子量测定膜蛋白电泳分离、分子量测定 sds-page 4.western blotting 鉴定鉴定-actin 实验报告要求实验报告要求： 分别按上各点，写出：原理，操作步骤，结果，讨论，结论分别按上各点，写出：原理，操作步骤，结果，讨论，结论 手写，手写，a4 纸大小纸大小 ，报告首页写明，报告首页写明 实验者，专业。实验者，专业。实验分组每个班分三大组，每组十人左右，选出组长每个班分三大组，每组十人左右，选出组长实

2、验进行一大组为单位实验进行一大组为单位 1.1.纯化纯化rbcrbc膜膜 2.sds-page 22.sds-page 2块胶（一个凝胶架）块胶（一个凝胶架） 3.western blot3.western blot 4.3-4 4.3-4 人一小组测定蛋白质含量人一小组测定蛋白质含量 一一.红细胞膜提取制备（低渗法红细胞膜提取制备（低渗法）原理：原理： rbc置低渗缓冲液置低渗缓冲液(ph7.4)，破裂溶血，破裂溶血 溶血液。溶血液。 溶血液置高速离心作用中，去除溶液中溶血液置高速离心作用中，去除溶液中hb和和其它内含物，制得纯净的其它内含物，制得纯净的rbc膜称为血影膜称为血影 “ghos

3、t”注意事项：注意事项：1.1.离心步骤一定要离心步骤一定要“平衡、对称放置平衡、对称放置”2.2.溶血液离心后上清吸取小心，以免丢失溶血液离心后上清吸取小心，以免丢失“膜膜”3. 3. 缓冲液缓冲液ph7.4ph7.4，偏酸使，偏酸使hbhb残留增加残留增加4.4.此分离方法适合于人、大鼠；牛、猪等易使此分离方法适合于人、大鼠；牛、猪等易使脂蛋白脱落，脂蛋白脱落，1mmcacl1mmcacl2 2可防止此种膜的不稳可防止此种膜的不稳定性。定性。5.5.本实验因条件限制，在常温离心。如需保持本实验因条件限制，在常温离心。如需保持蛋白活性，应在蛋白活性，应在4 4c c离心。离心。（1）rbc分

4、离：分离： 15 ml rbc液液 2000rpm 5分钟分钟 rbc（沉淀）（沉淀）3倍体积倍体积等渗等渗磷酸磷酸buffer 2000rpm 5分钟分钟2 洗净之洗净之rbc （2）溶血液制备）溶血液制备 rbc加入加入低渗低渗磷酸磷酸buffer（1:50) (在在 烧杯中）烧杯中） 稍搅拌稍搅拌 置冰箱冻格（置冰箱冻格（4c）溶血过夜）溶血过夜 （以上步骤已完成！）（以上步骤已完成！）溶血液，用溶血液，用“水泵水泵”吸去上清。吸去上清。 ！：膜很轻！：膜很轻二、二、 rbc膜纯化（洗涤）膜纯化（洗涤） rbc膜转至膜转至 1.5ml塑料管（塑料管（2个个/大组）大组） 9000rpm

5、5 沉淀（膜）沉淀（膜）低渗低渗磷酸磷酸buffer（ph7.4) ?ml （吹打）（吹打） 9000rpm 54 沉淀沉淀 等渗等渗磷酸磷酸buffer 1ml 9000rpm 5分钟分钟 沉淀（沉淀（rbc膜）膜）0.6ml等渗等渗buffer （即为（即为rbc原液）原液）三、三、 样品处理：样品处理： 1.sds-page用样品处理（一大组）：用样品处理（一大组）： 0.3ml rbc原液原液+0.3ml 样品溶解液样品溶解液 沸水浴沸水浴 5 2.lowry法测定用样品处理法测定用样品处理 (3-4 人人/group）： a. 取取0.3ml rbc原液原液 1.5ml h2o 15

6、0ul naoh 沸水浴沸水浴 5 待测管待测管1： 取取a液液0.1ml0.9ml h2o 待测管待测管2： 取取a液液0.3ml0.7ml h2o四、四、lowry法测定膜蛋白含量法测定膜蛋白含量立即摇匀，放置立即摇匀，放置15分钟。以第管为空白管，在分光光度计上以分钟。以第管为空白管，在分光光度计上以620比色，读取。比色，读取。以各管标准蛋白浓度为横座标，各管吸光度值为纵座标作图，画出标准曲线。以各管标准蛋白浓度为横座标，各管吸光度值为纵座标作图，画出标准曲线。2.2.红细胞膜样品蛋白含量的测定红细胞膜样品蛋白含量的测定 将待测管将待测管1、2同上加入碱性铜及酚试剂，一同测定同上加入碱

7、性铜及酚试剂，一同测定 管号管号试剂试剂h2o (ml) 0.90.80.60.40.21.0标准蛋白标准蛋白0.10.20.40.60.8_碱性铜试剂碱性铜试剂摇匀，放置分钟摇匀，放置分钟酚试剂酚试剂含标准蛋白含标准蛋白ug255010015020001.1.标准曲线制备标准曲线制备作图作图： 横坐标以标准蛋白含量横坐标以标准蛋白含量 纵坐标以纵坐标以a620a620吸光度值吸光度值 图比例应为图比例应为3:23:2（横：纵）（横：纵）计算：计算： 在标准曲线上查出待测样品的浓度，计算在标准曲线上查出待测样品的浓度，计算 提取膜的提取膜的 pr mgpr mg数数/ml/ml样品样品 注意稀

8、释倍数注意稀释倍数要求要求：计算原提取计算原提取rbcrbc液的液的prpr含量含量五、五、sds-page测定膜蛋白分子量测定膜蛋白分子量 不连续电泳系统不连续电泳系统： 电泳缓冲液电泳缓冲液ph离子强度与凝胶中不同（浓缩效应）离子强度与凝胶中不同（浓缩效应） （一）垂直板安装（一）垂直板安装 每套板两块玻璃下端对齐，每套板两块玻璃下端对齐，夹好，放在胶架上！夹好，放在胶架上！ （二）凝胶制备（见表）（二）凝胶制备（见表） 先配好分离胶（留距齿先配好分离胶（留距齿梳梳1cm），待其凝固后，），待其凝固后，再配浓缩胶。再配浓缩胶。 （三）电泳装置安装（三）电泳装置安装 先装内槽，试无渗漏；先装

9、内槽，试无渗漏； 放入外槽中，加放入外槽中，加buffer。 上样品：上样品： 每孔每孔18ul，2块块/组组 每块板留一每块板留一标准蛋白孔标准蛋白孔（四）（四） 电泳：电泳： 100v进分离胶调至进分离胶调至80v 约约1.5小时小时 10分离胶分离胶 10 ml5浓缩胶浓缩胶 5ml30凝胶储备液凝胶储备液3.31.0蒸馏水蒸馏水4.04.01.5mol/l tris-hcl buffer2.51mol/l tris-hcl buffer1.010sds0.10.0810 过硫酸铵过硫酸铵0.06（60ul)0.06(60ul)temed8ul8ul加入过硫酸铵，加入过硫酸铵，temed

10、即刻灌胶。即刻灌胶。（五）取胶（五）取胶: : 用专用板平面轻轻用专用板平面轻轻“橇橇”开板，推入小平皿中。开板，推入小平皿中。 注意：注意： 一块半干转移（浸入转移一块半干转移（浸入转移buffer20minbuffer20min） 另一块考马斯亮蓝染色另一块考马斯亮蓝染色 染色染色2 2小时后，小时后，7%7%醋酸脱色（醋酸脱色（4 4） 每组做好标记（写好名字），交生化室扫描或摄像每组做好标记（写好名字），交生化室扫描或摄像保留。保留。分子量计算分子量计算1.测量：测量： cmcm a.a.每条带距离每条带距离 （起始点至带中心）（起始点至带中心） b b. .起始至示踪染料距离起始至示

11、踪染料距离2. mr2. mr： 条带距离条带距离(a)(a) mr= mr= 起始至示踪染料距离起始至示踪染料距离 (b)(b)ab1410062403024分子量分子量kd迁移距离迁移距离cmmr705540352515预染标准蛋白3.半对数图：（六条标准蛋白）半对数图：（六条标准蛋白）（参照统计学散点法）参照统计学散点法） 横坐标横坐标为迁移率为迁移率mr 纵坐标纵坐标为为logm（直接按每一蛋白分子量标在半对数图中）（直接按每一蛋白分子量标在半对数图中）4.计算待测样品蛋白质分子量：计算待测样品蛋白质分子量： 选在标准蛋白迁移范围内的相应待测样品中的三选在标准蛋白迁移范围内的相应待测样

12、品中的三条带，测量距离计算条带，测量距离计算mr，mw 9876543210.1 0.2 0.3 0.4.横坐标为迁移率横坐标为迁移率mr；（六条标准蛋白）；（六条标准蛋白）纵坐标为纵坐标为logm（直接按每一标准蛋白分子量）（直接按每一标准蛋白分子量）2060100六、六、western blotting(-actin鉴定鉴定)1.转膜转膜 将与凝胶块将与凝胶块(切去多余部分切去多余部分)一般大小的一般大小的nc膜、滤纸均浸入转移膜、滤纸均浸入转移buffer中中20分钟，取出，在半干转移槽中按以下顺序放置：分钟，取出，在半干转移槽中按以下顺序放置： (上）上）阴极端阴极端 滤纸滤纸-凝胶凝胶-膜膜-滤纸滤纸 阳极端（下）阳极端（下） 用玻棒滚动去除空气气泡，盖好上盖。用玻棒滚动去除空气气泡，盖好上盖。 开启电源，调电压时间开启电源，调电压时间20 v， 20分钟分钟2.封闭封闭 将膜取出将膜取出tbst中洗中洗5，放置于封闭液中，放置于封闭液中10分钟，用分钟，用tbst洗洗53；3.一抗孵育一抗孵育 将膜放入已放一抗溶液塑料袋中，室温孵育将膜放入已放一抗溶液塑料袋中，室温孵育 1小时，用小时，用tbst洗洗5分钟分钟3；4.二抗孵育二抗孵育 将膜放入已放二抗溶液的