乙醛脱氢酶1在乳腺癌中的表达及临床意义

1、上海交通大学硕士学位论文乙醛脱氢酶1在乳腺癌中的表达及临床意义姓名：周凌申请学位级别：硕士专业：外科学（普通外科）指导教师：李克20090501scchnhsp9017-dmagsirnadeab头颈部鳞状上皮细胞癌热休克蛋白90热休克蛋白90功能特异性抑制剂小干扰rna二氨基苯卬醛squamous cell carcinoma of the head and neck heat shock protein 9017-dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin hydrochloride small interfering rnadieth

2、ylaminobenzaldehyde乙醛脱氢酶1在乳腺癌中的表达及临床意义摘要目的探讨干细胞标记物:乙醛脱氢酶1 （aldehyde dehydrogenas1,aldh1）在乳腺癌中的表达与临床意义。方法收集上海交通大学附属第一人民医院2003年1月至2008年3月乳腺癌病例92例。采用免疫组织化学染色法检测所有病例乳腺癌组织中 aldh1的表达，并结合临床病理参数进行无病生存期分析。所有实验数据 用%2检验或fisher精确检验，生存分析采用kaplan-meier法，采用 log-rank检验比较生存曲线的差异。采fflcox比例风险模型分析影响预后 的因素。采用spss 13. 0统

3、计软件包进行统计学处理，以po.05为差异有 统计学意义。结果aldh1的阳性表达率为18.5% o aldh1在乳腺癌组织中的阳性表达与pr、c-erbb-2有关（p<0.05）,与患者年龄、肿瘤大小、临床分期、 是否有淋巴结转移无关（p>0.05）。aldh邛印性组患者2年无病生存率显 著低于阴性组（pv0.05）,接受cef或te方案化疗和内分泌治疗的aldh1 阳性组患者2年无病生存率显著低于阴性组（pv0.05）,转移病例中， aldh1阳性组2年无病生存率显著低于阴性组（pv0.05）。结论aldh1表达阳性的乳腺癌细胞具有乳腺癌干细胞的部分特性：aldh1阳性细胞占肿

4、瘤细胞极少部分（<10%）；子代（转移灶）与母代肿 瘤的病理特征相似；aldh1表达阳性患者对化疗，内分泌治疗等常规辅助 治疗耐药，提示aldh1阳性细胞是-种“类干细胞”或具有干细胞潜能的细胞群落。乳腺癌aldh1表达阳性患者2年无病生存率显著低于乳腺癌aldh1表达阴性患者，证实乳腺癌aldh1表达阳性患者预后较差。使用aldh1免疫组化方法来鉴别乳腺癌组织内“类干细胞”群落，促进了肿瘤 干细胞概念在临床的应用。同时为今后乳腺癌靶向治疗提供了新的方向。关键词：乳腺肿瘤，干细胞，乙醛脱氢酶1,预后，免疫组织化学expressions of aldehyde dehydrogenas 1

5、 inbreast cancer and their clinical significanceabstractobjective the purpose of this study is to investigate the expression and clinical significance of aldehyde dehydrogenas 1 (aldh1) in breast cancermethods the expressions of aldh1 protein was examined by immunohistochemical staining in 92 breast

6、 cancer tissues the disease-free survival analysis of patients was evaluated based on the clinical follow-up data. the personal chi-square test was employed to examine the correlation between each variable and to investigate the statistically significant differences between molecular makers and clin

7、icopathological parameters. the disease- free survival (dfs) was estimated based on the kaplan-meier survival analysis, and the association between variables and survival was analyzed statistically by the log-rank test. for multivariate analysis, the cox regression model was used with 95% confidence

8、 intervals. all statistical analyses were carried out with spss(statistical package for the social sciences) for windows version 13.0 software. the results were considered to be statistically significant at p<0.05.results of all these 92 cases, 17 cases (18.5%) were observed as positive for aldh1

9、 expression in primary tumors. expressions of aldh1 protein had significant correlation with pr, c-erbb-2(p<0.05) 9but no significant correlation were found between the expression of aldh1 protein and age,tumor size.tnm stagejymph node status (p>0.05) .patients with a1dh1 positive tumors had l

10、ower 2year disease-free survival rate than that of those with aldh1 negative tumors(p<0.05). patients, who underwent chemotherapy and hormone therapy, with a1dh1 positive tumors had lower 2-year disease-free survival rate than that of those with aldh1 negative tumors(p<0.05). in the cases with

11、 lymph node metastasis, the 2-year disease-free survival rate of patients with aldh1 positive tumors was also lower than that of patients with aldh1 negative (p < 0.05).conclusion aldh1 positive cells form tumors from very few cells, recapitulate the heterogeneity of the parental tumor, and are s

12、electively resistant to chemotherapy and hormone therapy, all of which are hallmarks of cancer stem cells aldh1 positive cells may be a small population of breast cancer stem-like cells patients with a1dh1 positive tumors had lower 2-year disease-free survival rate than that of those with aldh1 nega

13、tive tumors, and aldh1 may be as a prognostic marker. aldh1 immunostaining is a simple method for identifying similar breast cancer stem cell-like populations this marker may facilitate the application of cancer stem cell biology to clinical practice. the development of aldh1 as a potential target f

14、or vaccination therapy will offer new hope to women with breast cancerkey words： breast neoplasms, stem cells, aldehyde dehydrogenas 1, prognosis, immunohistochemistry乙醛脱氢酶1在乳腺癌中的表达及临床意义亠八 冃ij 51997年由dick团队发现人类白血病起源于极小部分白血病干细胞，并且这种细 胞亚群能在nod/scid (nonobese diabetic /severe combined immunodeficient,

15、非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠中形成白血病，首次用实验证据证实肿瘤干 细胞的假设1。2001年taipale j提出“肿瘤十细胞”理论2。2003年a1-hajj3进一 步拓展了这个概念，他的团队发现人类乳腺癌包含了一小部分表面分子标记为 cd44+/cd24-/lin-的细胞群拥有十细胞特性，第一次证实了乳腺癌干细胞的存在。随 后肿瘤干细胞的理论一直被不断的论证和修定。如今大量种类的的肿瘤干细胞被鉴 定及分离出来，包插脑癌，前列腺癌，恶性黑色素瘤，结肠癌，胰腺癌，头颈部鳞 癌等4-1 lo 一些研究支持这样一种假设，即肿瘤干细胞来源于正常的细胞起源(干细 胞或起始细胞)，由于致癌因素导

16、致了正常细胞的恶性转化12, 13。于是人们开始志 力于寻找一种建立于细胞功能的肿瘤干细胞的标记物，这种标记物在起源细胞内存 在，并能遗传到同样起源的致变的恶性干细胞内。乙醛脱氢酶1 (aldehyde dehydrogenas 1,aldh1)就是这样一个候选指标。乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenas ,aldh) 14是组能将乙醛氧化成乙酸的 同工酶，能保护细胞避免醛过氧化物的损害。john p chute 15等研究证明了aldh1在 干细胞的早期分化中起了重要的作用。有报道显示aldh高度聚焦在人类造血干细胞 (hematopoietic stem cells , h

17、scs) 16和神经系统十细胞4, 5,在多发性骨髓瘤 和急性粒细胞白血病中也发现肿瘤细胞的aldh活性有所增高17, 18o于是aldh活性成 为了正常和恶性肿瘤干细胞的共同的功能性的标记物。balicki d19等使用aldh1帮 助鉴别和分离恶性人乳腺干细胞。结果aldh1-阳性乳腺恶性肿瘤细胞显示了肿瘤干 细胞的特性，即能够自我更新，自我分化。作为一个乳腺癌干细胞的潜在标记物，aldh1的鉴定在乳腺癌的研究道路中开创了重要的新的方向。国外一些研究发现乙醛脱氢酶1是鉴别乳腺癌干细胞的指标之一，乳腺癌患者若 肿瘤高表达aldh1则预后不良20o国内乳腺癌研究中鲜见相关报道。本研究希望通过

18、免疫组织化学方法，检测aldh1蛋白在乳腺癌患者中的表达情况，并对aldh1蛋白的 表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系进行分析，观察aldh1表达阳性的乳腺癌患者 对常规的化疗及内分泌治疗的敏感性如何以及预后如何，从而给今后的乳腺癌临床 治疗带来一些启示。材料与方法一、临床资料收集上海交通大学附属第一人民医院2003年1月2008年3月乳腺癌病例，除外 导管内癌、iv期乳腺癌、采用新辅助化疗以及随访资料不完整的病例，共计有92例 乳腺癌病例入选本项研究，其中有淋巴结转移的病例48人，无淋巴结转移病例44人。 患者均为女性。发病年龄2783岁（56.49土12.40）,中位年龄55.5岁。所有病

19、例 均进行乳腺癌改良根治术。随访吋间为664个月（28.90±15.88）,中位随访时间 26个月。病理组织学分类采用2003年乳腺肿瘤who组织学分类标准：乳腺浸润癌（浸 润性导管癌或小叶癌）86例，粘液腺癌3例，髓样癌3例。根据中国抗癌协会乳腺癌诊 治指南与规范（2007版）中的tnm分期标准进行临床分期：i期26人，ii期49人，iii 期17人。术后根据患者临床分期、er、pr、c-erbb-2的情况进行辅助化疗及辅助内 分泌治疗。其中84人接受了化疗：cmf （环磷酰胺，氨甲喋吟，5-氟尿卩密喘）方案14 人共6个疗程,cef （环磷酰胺，表阿霉素，5-氟尿卩密喘）方案55

20、人共6个疗程,te （泰 素，表阿霉素）方案15人共6个疗程；8人未化疗。化疗结束后，er或pr阳性患者行 三苯氧胺内分泌治疗60人，治疗剂量为：20mg, 2次/日，口服。本项研究共收集92 例乳腺癌原发灶及48例转移淋巴结。手术切除标本均经10%福尔马林常规固定，常规 脱水，包埋，蜡块存档待检。二、主要材料2.1 主要仪器leica rm2016石蜡切片机海尔冰箱pyx-dhs-40x50-bs- ii电热恒温培养箱olympus bx51tf显微镜2.2主要试剂兔抗人aldh1免疫组化多克隆抗体：100（11 编号 ab51028美国abcame公司，上海优宁维公司代购鼠抗人h er-2

21、/neu/c-erbb-2免疫组化单克隆抗体：0.2ml（浓缩型）编号m-0196克隆号e2-4001 +3b5上海长岛生物技术有限公司鼠抗人er （estrogem receptor）免疫组化单克隆抗体：0.2ml（浓缩型）编号m-00241克隆号1d5上海长岛生物技术有限公司鼠抗人pr （progesterone receptor）免疫组化单克隆抗体：0.2ml（浓缩型）编号m-0448克隆号1a6上海长岛生物技术有限公司羊抗兔二抗：编号d-3002上海长岛生物技术有限公司即用型非生物素广谱二抗：编号d-3004上海长岛生物技术有限公司柠檬酸抗原修复缓冲液pbs乙醇二甲苯dab发色剂苏木素

22、三、实验方法3.1免疫组织化学染色（sp法）玻片预先进行防脱处理，所选肿瘤蜡块均切取2屮11厚切片数张，置于68°c烤箱 中烘干备用。以已知阳性片作阳性对照，用pbs代替一抗作阴性对照。1石蜡切片置于二甲苯中常规脱蜡，10分钟x3次；2梯度乙醇（100%、90%、70%）脱二卬苯，5分钟x3次；3.蒸馆水洗去多余的乙醇；4切片置于柠檬酸缓冲液ph6.0热修复30分钟，室温自然冷却30分钟，以充分暴露抗 原；5. pbs洗涤，3分钟x3次;6. 每张切片滴加适量3%h202室温下孵育5分钟，阻断内源性过氧化物酶；7. pbs液洗涤2分钟x3次；8.3%正常羊血清室温下封闭孵育20分钟以

23、阻断非特异性染色；9. 每张切片滴加特异性一抗，4°c过夜：aldh1抗的工作浓度为1： 100；c-erbb-2抗的工作浓度为1： 170；er抗的工作浓度为1： 100；pr抗的工作浓度为1： 100；10. pbs液洗涤2分钟x3次；11. 滴加适量二抗37°c30分钟：aldh1为d-3002羊抗兔二抗；其余均使用即用型广谱二抗；12. pbs液洗涤2分钟x3次；13. 切片置于dab液中显色，不超过10分钟（镜下控制）:14. 蒸幅水漂洗终止反应；15苏木精复染细胞核，逆梯度乙醇脱水，十燥后中性树胶封片。3.2免疫组化结果判定3.2.1 aldh1由于aldh1蛋

24、白免疫组化判定标准在国内外均未见报道。参考abcame公司网站中aldh1阳性表达的情况以及国内外其它蛋白免疫组化判定方法21,制定了本研究的 aldh1蛋白的免疫组化判定标准。每张切片随机选取10个高倍视野，每个视野计数100 个细胞，取其均值。aldh1染色主要位于细胞浆，呈棕黄色弥漫性分布。据染色强度 及显色细胞比例，对染色结果进行分级。按切片中细胞有无显色及深浅评分：无显 色为0分、浅棕色为1分，深棕色为2分。按显色细胞比例评分：0%10%为0分， 11%30%为1分，引70%为2分，>刀为3分。以上2种评分之和为每例的积 分，按积分高低分为：0分为阴性（一），02分为低表达（+

25、 ） , 35分为高表达（+）。 结果统计吋将其分为aldh1阳性表达组（“+”）和阴性表达组（“一”）。3.2.2 c-erbb-2评分参考hercept test的标准及欧美最新的临床实验室标准22阳性结果定位于 细胞膜，根据阳性细胞的比例分为4个级别：阴性（一），无阳性结果表达；弱阳性什）， <10%的区域有阳性表达，胞膜显色不连续；中度阳性（+）, >10%的区域有阳性表达， 胞膜显色不连续；强阳性（+）, >10%的区域有阳性表达，胞膜显色连续。由于按 asco/cap组织推荐c-erbb-2的免疫组化判断标准，高表达者（“+”）与荧光原位杂 交检测所显示的基因扩增

26、结果高度对应，对于临床治疗有指导意义，故本文主要关 注c-erbb-2的高表达情况，结果统计时，将其分为c-erbb-2的高表达组（“+”）和 非高表达组（阴性、“+”）o3.2.3 er 及 pr以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，按切片中细胞有无显色及深浅评分： 无显色为0分、弱显色为1分，中等强度为2分，强显色为3分。按显色细胞比例 评分：0%为0分，<1%为1分，1%10%为2分，10%33%为3分,33% 67%为4分,>67%为5分。以上2种评分之和为每例的积分，如果积分大于3分， 视为er、pr阳性表达23。免疫结果由两位有经验的病理医师对染色结果作出判定。er、pr

27、、c-erbb-2指 标均作为临床病理特征辅助应用于aldh1的表达分析。四、随访分析:对92例乳腺癌病例进行回顾性分析。随访期限从手术后病理确诊为乳腺癌开始 至复发或转移或死亡或随访终止时间(200891)。五、统计分析：所有实验数据用检验或fisher精确检验，生存分析采用kaplan meier法，采 用log-rank检验比较生存曲线的差异。采用cox比例风险模型分析影响预后的因素。 采用spss13. 0统计软件包进行统计学处理，以p<0.05为差异有统计学意义。生存期 的计算是从手术日期始到随访日期终止或由于复发、转移而死亡的日期或失访日期 为止。无病生存期(disease

28、free survival，dfs)为患者自手术切除肿瘤之日始至 复发或远处转移的吋间。一、乳腺癌原发灶与转移淋巴结中aldh1的表达92例乳腺癌原发灶中，aldh1阳性表达17例（18.5%）,其中低表达16例、高表 达1例。48例转移淋巴结中，aldh1阳性表达8例（16.7%），其中低表达7例、高表达 1例。在所有低表达的切片中，aldh1阳性细胞占肿瘤细胞总数的比例均小于10%。 高表达的切片在原发灶及转移灶中各1例，来自同一病例，aldh1阳性细胞占肿瘤细 胞总数的比例小于30% （见图1） o48例伴有淋巴结转移的病例中，原发灶aldh1阳性表达8例，其相应转移灶aldh1 阳性表

29、达7例；原发灶aldh1阴性表达40例，其相应转移灶阴性表达39例。转移淋巴 结中aldh1的表达与相应的原发灶中aldh1的表达呈正相关（p = 0.000, fisher精确 检验）（见表1）。鹵1免疫殂化检测aldh1农轧腺癌1顔内的表达(函fig 1 expression of aldh1 in breast cancer tissue(sp )的乳腺癌组织图a：(sp/50)aldh1表达为“一的乳腺癌组织(sp,x400)图c：aldh1表达为的乳腺癌组织(sp/50)aldh1表达为“+”的乳腺癌组织图e：图f：(sp/400)aldh1表达为“+”的乳腺癌组织(sp/50)al

30、dh1表达为“+ +"的乳腺癌组织(sp/400)转移灶aldh1合计原发灶aldh1阴性阳性表1乳腺癌原发灶aldh1表达与转移灶aldh1表达阳性率的比较table 1comparison of aldh1 expression in primary breast cancer and its coitespondingmetastatic lymph node0.00040 39 1阴性阳性8 1 7fisher精确检验二、aldh1的表达与乳腺癌临床病理特征的关系1. aldh1的表达与c-erbb-2的关系92例病人的原发灶中，c-erbb-2低表达组共71例，其中aldh

31、1阳性8例（11.3%）,c-erbb-211表达组共21例，其中aldh1阳性9例（42.9%） , aldh1表达与c-erbb-2的 过表达（+）呈正相关（p = 0.003 , fisher精确检验）（见表2）。表2 aldh1与c-erbb2的关系table 2 relationship between aldhland c-erbb-2aldh1c-erbb-2 合计p值阴性阳性低表达71 63 80.003fisher精确检验 高表达21 12 92. aldh1的表达与pr的关系92例病人的原发灶中,pr阴性组共37例,其中aldh1阳性11例（29.7%） , pr阳性组共5

32、5例，其中aldh1阳性6例（10.9%） , aldh1表达与pr的阴性表达呈正相关（p= 0.023）（见表3） o表3 aldh1与pr的关系table 3 relationship between aldhland prpr合计aldh1阴性阳性0.023阴性37 26 11阳性55 49 63. aldh1的表达与er的关系92例病人的原发灶中er阴性组共36例,其中aldh1阳性10例(27.8%) , er阳性组共56例，其中aldh1阳性7例(12.5%) aldh1的阳性表达与er的阴性表达呈弱相关 (p = 0.065)(见表4),但是有正相关趋势。表4 aldh1与er的

33、关系table 4 relationship between aldh1 and eraldh1er合计p值阴性阳性阴性36 26 100.065阳性56 49 74. aldh1的表达与淋巴结状态的关系92例病人的原发灶中,淋巴结未转移组共44例，其中aldh邛日性9例(20.5%),淋巴结转移组共48例，其中aldh1阳性8例(16.7%) , aldh1表达与淋巴结是否转移 无显著性相关(p = 0.640)(见表5)。表5 aldh1与淋巴结状态的关系table5 relationship between aldh1 and lymph node status淋巴结转移合计aldh1阴

34、性阳性p值阴性44 35 90.640阳性48 40 85. aldh1的表达与年龄，临床分期，肿瘤大小，化疗方案的选择的关系92例病人的原发灶中aldh1的阳性表达与患者年龄、肿瘤大小，临床分期及化疗 方案的选择均无关(p>0.05)(见表6)。表6 aldh1与患者年龄、肿瘤大小，临床分期及化疗方案的关系table 6 relationship between aldhland age,tumor size,tnm stage and chemotherapyaldh1病理参数合计值阴性阳性1年龄(岁)0.929w50 37 30 7>50 55 45 10临床分期 1.000

35、 fisher确检验i 26 21 5ii 49 40 9iii 17 143肿瘤大小(d/cm)0.865w2 47 38 9>2 45 37 8化疗方案 0.341 fisher确检验无8 80cmf 14 13 1cef 55 42 13te 15 12 3通过分层分析，55例接受cef方案化疗、15例接受te方案化疗及60例接受内分泌治疗的病例，aldh1的表达与患者年龄、肿瘤大小、临床分期、是否有淋巴结转移均 无显著性相关(p>0.05)(未列表)。三、aldh1表达与乳腺癌无病生存期的关系1. aldh1表达与92例乳腺癌患者总无病生存期的关系92例病人都获得随访。al

36、dh1表达阳性组无病生存期为(37.02土5.31)个月，2 年无病生存率为58.8%； aldh1表达阴性组无病生存期为(57.58±2.13)个月，2 年无病生存率为89.3% o aldh1表达阳性组2年无病生存率显著低于阴性组，差异 有统计学意义(p = 0.004)(见图2)。0.8aldhl-negative0.6-aldhl-positive1ii!lf" 1f0.4-0.2-p=0. 0040.0-0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.00图2 92例乳腺癌患者aldhlffl性组与aldh1阴性组无病工存曲线fig. 2

37、 kaplan-meier disease-free survival curves of 92 breast cancer patients2. aldh1表达与48例伴有淋巴结转移的乳腺癌患者无病生存期的关系1.00.80.6-0.4-p=0. 00848例转移病例中，aldh1表达阳性组无病生存期为(2922±7.14)个月，2年 无病生存率为37.5%； aldh1表达阴性组无病生存期为(54.31±3.33)个月，2年无 病生存率为82.5% o aldh1阳性组2年无病生存率显著低于阴性组，差异有统计学意 义(p = 0.008)(见图3) o0.2-0.0-0

38、.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.00t/jssont/j图3 48例淋巴结转移患者aldh1阳性组与aldh1阴性组无病生存曲线fig. 3 kaplan-meier disease-free survival curves of 48 breast cancer patients withlymph node metastasis3. aldhl表达与55例接受cef方案化疗的乳腺癌患者无病生存期的关系55例接受cef方案病例，aldh1表达阳性组无病生存期为(3805±6.05)个月，2年无病生存率为61.5%； aldh1表达阴性组无病生存期为(59.71±2.39)个月，2年无病生存率为92.9% o aldh1阳性组2年无病生存率显著低于阴性组，差异有统计学意义(p = 0.008)(见图4) o1.0-lh-q一上一丄 1.1上丄丄aldhl-negativev vii n t f lft1-h-0.8-aldhl-positive0.4-0.2-0.0-0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.00图4 cef方案患者aldh1阳性组与aldh1阴性组无病生存曲线fig. 4 kapla