一种用于细胞核成像的新型双光子荧光探针

1、Vol .30高等学校化学学报No .32009年3月CHE M I CAL JOURNAL OF CH I N ESE UN I V ERSI TI ES 465467研究快报一种用于细胞核成像的新型双光子荧光探针刘鑫1,刘恒1,贾鹏飞1,张波1,王军杰2,赵宁2,张元红2,于晓强2(1.兰州大学生命科学学院,兰州730000;2.山东大学晶体材料国家重点实验室,济南250100关键词双光子荧光探针;双光子荧光成像;核酸中图分类号O657文献标识码A 文章编号025120790(20090320465203 收稿日期:2008212202.基金项目:国家自然科学基金(批准号:50673053

2、,NSFC /RGC 50218001,50173015和30771091资助.联系人简介:刘恒,男,博士,副教授,主要从事细胞生物学研究.E 2mail:hengliulzu .edu .cn于晓强,男,博士,教授,主要从事双光子材料研究.E 2mail:yuxqsdu .edu .cn与共焦显微镜相比,双光子荧光显微镜(TP M 在生命科学研究中具有较大的优势1.其表现在避免了生物样品的紫外光损伤、光漂白和焦平面外的荧光干扰等.检测光路中不采用小孔光栅,对成像多自发荧光和高散射样品也有独特的优势2,因此被认为是生物成像领域革命性的发展3.然而,双光子荧光显微镜的进一步应用却因缺乏具有优良双

3、光子荧光探针而受到制约4,5.单光子和双光子的吸收过程遵循不同的选择规则6,因此传统探针的双光子荧光活性吸收截面(×较小,量子产率偏低7.大双光子荧光活性吸收截面的探针分子的缺乏制约了双光子荧光显微镜对激光共焦显微镜的竞争力.目前,双光子荧光探针的设计和合成已经引起广泛的关注8.核酸是与生命活动和疾病密切相关的生命大分子,但针对核成像的双光子核酸荧光探针的研究却鲜有报道9.一些利用双光子显微镜的研究仍使用小吸收截面的Hochest 和DAP I 等传统探针10.本文报道了具有大双光子活性吸收截面的DNA 探针BMVEC,同时首次利用双光子显微镜完成了与DAP I 的复染实验,实验结果

4、证实了BMVEC 对细胞核的选择性标记能力.1实验部分1.1探针的合成首先,用N 2乙基咔唑通过V ils meier 反应合成中间体92乙基23,62二甲酰基咔唑,同时利用碘甲烷合成中间体42甲基2N 2甲基碘盐.然后在哌啶的催化下以甲醇为溶剂用2个中间体合成最终产物3,62双(12甲基242乙烯基吡啶292乙基咔唑碘盐(BMVEC (Sche me 1,经过核磁、质谱和元素分析证明其为目标产物.Sche m e 1Syn theti c routes of B M VEC1.2光谱性质的测定吸收光谱和荧光光谱用Perkin El m er La mbda 235和H I T ACH F 2

5、4500测定;双光子荧光用Spectr oPr o300i 记录,泵浦光源为CoherentM ira9002D 飞秒脉冲激光.1.3细胞培养及染色采用人宫颈癌Hela 细胞,DME M 培养基培养.染色后用Zeiss LS M (Laser Sca 2ning M icr oscopy,德国510成像.2结果与讨论2.1探针与DNA 相互作用的吸收光谱为了阐明探针和双链DNA 的作用机理,进行了紫外光谱监控下DNA 对探针的滴定实验(见图1.由图1可见,随着DNA 的加入,探针的线性吸收光谱明显改F i g .1D NA concen tra ti on dependen t absorpt

6、i on property1.UV 2V is s pectra of free BMVEC;2.UV 2V is s pectra of BMVEC saturated with DNA.变.箭头1和2所指的分别为自由状态下和所有探针分子完全结合时的吸收光谱.在自由状态下,吸收峰在444n m 处的吸光度为011359,随着DNA 的不断加入,吸收峰逐渐红移,也出现了明显的增色效应.当DNA 的加入量达到饱和时,吸收峰和吸光度不再变化,峰位和吸光度分别为466n m 和012127.说明探针分子和DNA 之间存在着相互作用,一般认为这种相互作用体现为探针分子插入了DNA 分子的沟渠中,这是D

7、NA 分子光开关的常见现象11,实验中的探针分子先发生减色效应,随后发生增色效应,这在DNA 探针的研究中尚未见报道.2.2溶剂和DNA 对探针荧光量子效率的影响表1给出了探针的一系列光谱测试数据,其中,1和2是线性吸收和单光子荧光的峰位,A 是吸光度,是摩尔消光系数,是量子产率,和×分别是双光子吸收截面和活性吸收截面.表1中的数据说明,探针分子存在明显的溶剂化效应.在水相中,BMVEC 只有很低的荧光量子效率,在有机相中,探针的值有很大增加,当探针分子完全结合到DNA 中时,其量子效率达到3018%,与水相中相比增加了181倍.完全达到了DNA 分子光开关的要求.可以认为这是由以下

8、两个因素所致:(1当BM 2VEC 插入到DNA 的沟渠中后,周围不再有猝灭荧光的水分子12;(2结合作用使探针的分子内扭曲运动受阻,分子的刚性增加,提高了BMVEC 辐射跃迁的比例13.Table 1Spectroscop i c da t a of B M VEC i n var i ous env i ronm en ts Solvent1/nm 2/nm A /a .u ./(L mol -1c m -1(%/G M ×/G M Ethanol45859301207192×10441131001136215Buffer44456101153106×1040

9、122224944817DNA sat 46753701224135×1043018467014372.3DNA 对双光子荧光探针性能的影响图2表明探针的双光子荧光强度随DNA 的加入不断增加,F i g .2Var i a ti on of the two 2photon exc ited fluorescencespectra w ith the add iti on of D NA i n to aqueous soluti on s of B M VEC Excited wavelength:800nm.这是BMVEC 能够成为双光子荧光探针的基本因素.当DNA 碱基对与探针

10、分子的摩尔比14达到151251时,双光子荧光增加达到饱和.与探针分子在水相中的双光子荧光强度相比,饱和DNA条件的双光子荧光放大了37倍.根据表1中的实验结果,BMVEC 也有较大的双光子吸收截面和双光子活性吸收截面.传统的DNA 荧光探针,如DAP I 的双光子吸收和活性截面分别为7和0116G M 4.文献报道的两个双光子荧光探针的吸收截面分别为350和700G M ,活性截面则未见报道9.2.4双光子荧光显微镜下的双染实验鉴于细胞环境中有许多生物大分子的干扰,为了验证BM 2VEC 作为双光子生物荧光探针的潜力,以固定后的人体宫颈癌Hela 细胞为观测样品,进行双染试验.首先用011m

11、ol/L 的BMVEC 染色30m in,然后再用1mol/L 的DAP I 复染5m in .经实验证实两者的成像光路互不交叉,然后分别选用它们各自的光路成像,BMVEC 和DAP I 的成像光路分别为535590nm 和435485nm ,激发光波长均为800n m ,功率分别为总功率的3%(BMVEC 和8%(DAP I .做图片叠加,实验结果如图3所示.图3(A 为BMVEC 的荧光图像,图3(B 是DAP I 的荧光图像,两者荧光成像的位置、形态和数量完全一致,说明664高等学校化学学报Vol .30 F i g .3Cost a i n i n g photos of B M VE

12、C and DAP IBMVEC 具备与DAP I 相同的细胞核定位能力.图3(C 为蓝色(代表DAP I 和红色(代表BMVEC 的叠加图,进一步证实了两者的一致性,充分证明BMVEC 是极具有潜力的核成像的双光子荧光探针.参考文献1Hel m chen F .,Denk W.Nat .MethodsJ ,2005,2(12:9329402Denk W.,Strickler J.H.,W ebb W.W.ScienceJ ,1990,248:73763Masters B.R.,So P .T .C .M icr osc .Res .Tech .J ,2004,63(1:3114So P .T

13、 .C .,Dong C .Y .,Masters B.R.,et al .Annu .Rev .B i omed .Eng .J ,2000,2:3994295Y U Xiao 2Q iang (于晓强,T AO Xu 2Tang (陶绪堂,J I A NG M in 2Hua (蒋民华.University Che m istry (大学化学J ,2008,23(1:176Goppert 2MayerM.Ann .Phys .(Lei pzig J ,1931,9:2732947Xu C .,W ebb W.W.J.Op t .Soc .Am.B J ,1996,13:4814918Ki

14、m H.M.,Jung C .,Ki m B.R.,et al .Ange w .Chem.I nt .Ed .J ,2007,46:346034639A llain C .,Schm idt F .,Lartia R.,et al .Che mbi oche m.J ,2007,8(4:4243310Feij J. A.,Cox G .M icr on .J ,2001,32:67968411Mariappan M.,Maiya B.G .Eur .J.I norg .Che m.J ,2005,11:2164217312Woo H.Y .,Hong J.W.,L iu B.,et al .

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16、Heng 13,J I A Peng 2Fei 1,ZHANG Bo 1,WANG Jun 2J ie 2,ZHAO N ing 2,ZHANG Yuan 2Hong 2,Y U Xiao 2Q iang 23(1.School of L ife Science,L anzhou U niversity,L anzhou 730000,China;2.S tate Key L ab of C rystal M aterials,Shandong U niversity,J inan 250100,China Abstract A ne w t w o 2phot on fluorescence

17、 DNA p r obe,BMVEC,with bigger ×(1437G M was synthe 2sized .The abs or p ti on titrati on shows that there is an interacti on bet w een BMVEC and DNA because the p r obe can intercalate the gr ooves in the double helix of DNA ,which enhances its t w o 2phot on fluorescent intensity .Mean while the double 2staining results in cancer cells by means of TP M de monstrate the exclusive nucleic labe 2ling ability of BMVEC,and the positi ons and a mounts of nuclei labeled by BMVEC are wholly the identical as those by DAP I .Moreover,t