微生物检验方法验证方案(3)

1、. 微生物限度检验方法验证方案微生物限度检查方法（平皿法）验证方案微生物限度检查法验证方案16微生物限度检查检验方法验证报告微生物限度检验方法验证方案1.适用范围本方案适用于本公司各品种微生物限度检验方法的验证。2.目的通过验证确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度的测定 。3.职责项目责任人：负责验证方案的起草及具体实施。验证管理员：负责验证工作的组织、协调及管理。QA现场监控员：负责验证实施过程中的监督检查，取样，确保结果的可靠性。QC负责人：负责验证方案中检验方法的审核及按照规定的取样计划对标准检验操作程序的准确执行，负责组织实施。QC检验员：负责验证方案的起草与参与实施，并对所测数据

2、准确性负责。质量部经理：负责验证方案及报告的审核和批准。4.内容4.1.概述通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。4.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。.验证试验可与供试

3、品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。4.2.1.验证用菌株及菌种要求大肠埃希菌【CMCC（B）44102】、金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】、黑曲霉【CMCC（F）98003】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】。 大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，前述菌株作为细菌计数验证用菌株；黑曲霉为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌及酵母菌计数验证用菌株。验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代 （从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0 代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。4.2.

4、2.验证菌菌液制备4.2.2.1.大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液制备：接种大肠埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养琼脂培养基中，3537培养1824小时。取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-610-7，制成每1ml含菌数50100cfu的菌悬液。4.2.2.2.白色念珠菌菌液制备：接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，2328培养2448小时；取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-610-7，制成每1ml含菌数50100cfu的菌悬液。4.2.2.3.

5、接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，2328培养57天，加入35ml 0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，吸至无菌试管内，取1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-410-6，制成每1ml含孢子数50100cfu的孢子悬液。4.2.3. 供试液的制备4.2.3.1.无抑菌活性的供试品供试液的制备稀释剂：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液液体供试品：供试品10ml置锥形瓶中，加入90ml稀释剂，混匀，作为供试液（1：10）。固体、半固体、粘稠性供试品供试品： 称取供试品10g置锥形瓶中，加稀释剂至100ml，混匀后，作为供试液（1：10）。4.2.3

6、.2.具有抑菌活性的供试品供试液的制备当供试品具有抑菌活性时，须先消除抑菌活性，其方法如下：培养基稀释法：取供试液2ml，每0.2ml的供试液注一皿或每0.1ml的供试液注一皿；或取供试液1ml每0.5ml的供试液注一皿，倾注15ml的培养基，测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数，混匀，凝固，培养。每1ml供试液所注的平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数。计算每1ml供试液的平均菌落数， 按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时可加大增菌液的用量。离心沉淀集菌法：取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分钟离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2

7、ml，加稀释液补至原量。薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，按薄膜过滤法测定其菌落数。中和法：选取适宜的中和剂如磺胺类药物加入适当的对氨基苯甲酸，含重金属的药物在培养基内加入巯基化合物如硫乙醇酸钠-半胱氨酸，洗必泰制剂加入聚山梨酸80（3%）或卵磷脂（3%），卤素中加入硫代硫酸钠（0.1%）等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性后测定。4.2.4. 菌液组 测定所加的试验菌数。采用平皿法，取试验用的1ml菌液（约50100cfu）分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。4.2.5.试验组4.2.5.1.平皿法：取试验可能

8、用的最低稀释级1ml供试液和50100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。4.2.5.2.培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级1ml供试液分别注入N个平皿中，每个平皿再注入50100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。4.2.5.3薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌落数。至少要一张膜。4.2.5.4.离心沉淀集菌法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，如供试液含

9、许多药渣，先以500转/分钟离心35分钟，取全部上清液，再以3000转/分离心20分钟，取下面1ml液体，并用稀释剂洗涤管底，将洗涤液与1ml液体一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。4.2.6. 供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数（方法和试验组相同）。4.2.7.稀释剂对照组若供试液需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤法等处理时，应增加稀释剂对照组，用稀释剂代替供试品，加入试验菌，使最终浓度为每1ml 供试液含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和计数方法计数。4.2.8.回收率计算4.2.8.1.试验组回收率计算试验组的菌回收率试验组的菌回收率供试品对照组平均菌落

10、数×100%菌液组的平均菌落数4.2.8.2. 稀释剂对照组回收率计算试验组的菌回收率稀释剂对照组平均菌落数×100%菌液组的平均菌落数计数方法验证至少应进行3次独立平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。4.2.8.结果判断 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）70%。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）70%。照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用自然沉降法、培养基稀释法

11、、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证，使试验组菌回收率大于70%。4.3. 控制菌检验方法验证当建立药品的微生物限度检查时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的的控制菌检查方法测定。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应进行重新验证。验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。4.3.1.验证用菌株大肠埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】、金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】、乙型付伤寒沙门菌（Salmonell

12、a paratyphi B）【CMCC(B) 50094】、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代 （从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0 代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。4.3.2.菌液制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，3537培养1824小时；分别取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7，制成每1ml含菌数10100cfu的菌悬液。4.3.3.阴性菌对照组 设立

13、阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。4.3.4.试验组 4.3.4.1.常规法大肠埃希菌 取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入大肠埃希菌10100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10100cfu，3537培养1824小时，取此培养物按微生物限度检查SOP大肠埃希菌项下规定检查。大肠菌群 取含适量（不少于10ml）的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入含供试品1g

14、或1ml 、0.1g或0.1ml、含供试品0.001g或0.001ml的供试液，阳性菌对照加入大肠埃希菌10100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10100cfu，3537培养1824小时，按微生物限度检查SOP大肠菌群项下规定检查。 沙门菌 取供试品10g或10ml，直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，阳性菌对照加入沙门菌 10100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10100cfu，3537培养1824小时。按微生物限度检查SOP沙门菌项下规定检查。 铜绿假单胞菌 取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳

15、性菌对照加入铜绿假单胞菌10100cfu，阴性菌对照加入大肠埃希菌10100cfu，3537培养1824小时。按微生物限度检查SOP沙门菌项下规定检查。 金黄色葡萄球菌 取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入金黄色葡萄球菌10100cfu，阴性菌对照加入大肠埃希菌10100cfu，3537培养1824小时。按微生物限度检查SOP金黄色葡萄球菌项下规定检查。4.3.4.2. 培养基稀释法 供试品有抑菌作用，放大培养基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器体积限制，一般放大到500ml或1000ml，本法适用于抑菌作用不强的样品

16、。4.3.4.3. 薄膜过滤法 采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。4.3.4.4. 离心沉淀集菌法 取规定量供试液，如供试液含许多药渣，先以500转/分钟离心35分钟，取全部上清液，再以3000转/分离心20分钟，取下面1ml液体，并将适量的稀释剂洗涤管底的洗涤液一并移入同瓶增菌液中，培养，本法适用于中度抑菌作用的样品。4.3.4.5.中和法 在供试品溶液中加入相应的中和剂，以减除供试品中抑菌成分的作用，中和剂应对微生物无毒性，与抑菌成分结合后的产物应对微生物亦无毒性，或有毒性但不影响待检菌的检出。4.3.

17、5.结果判断至少应进行3次独立平行试验。阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，照该供试液制备方法和控制菌检查法进行该供试品控制菌的检查；若试验组未检出试验菌，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。5.验证的实施5.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证记录及控制菌检验方法验证记录(见附件)。5.2.分析数据，综合整个验证过程，得出验证结论。5.3.验证过程中发生的异常情况，按照偏差处理程序进行处理。6.相关文件微生物限度检查SOP 7.再验证7.1.药品的组分发生改变可能影响检验结果时。7.2

18、.验证时检验条件发生改变可能影响检验结果时。微生物限度检查方法（平皿法）验证方案目 录一、 验证方案的制定二、 验证方案的起草与审批三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案1验证目的和原理2验证方法步骤3试验实施3.1试验前的准备3.2验证试验操作3.3试验结果4验证结果评价分析5附件微生物限度检查方法（平皿法）验证文件一、 验证方案的制定验证项目名称微生物限度检查方法（平皿法）验证编号VF-PR-17-A验证小组组员成员职务姓名主要工作职责组长方案设计责任人副组长方案实施负责人组员操作人操作人操作人操作人验证方案组织实施进度步骤实施日期二、 验证方案的起草与审批1验证方案的起草验证项目名称微

19、生物限度检查方法（平皿法）验证编号VF-PR-17-A起草部门起草人签名日期生产部年 月 日质控部年 月 日2验证方案的审核与批准验证方案审核人： 审核日期： 年 月 日验证方案批准人： 批准日期： 年 月 日三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案1验证目的和原理1.1 验证目的 为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。1.2 原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。2验证方法步骤2.1验证前的准备 进行微生物限度检查方法（平皿

20、法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。试验菌应包括G-、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。2.2验证试验的操作计划 用3个不同批号产品按照微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断微生物限度检查方法是否对产品有影响。2.3试验结果可接受标准 用标准菌株评价方法“尿素维生素E乳膏的微生物限度检查”对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组的回收率也不低于70%。3试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：高压蒸汽灭菌器、恒温烘干箱、净化

21、工作台、生物安全柜、恒温培养箱、霉菌培养箱。3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层流装置。环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或防置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。3.1.3试验样品： 尿素维生素E乳膏：批号 批号 批号 3.1.4稀释液和试剂： PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 无菌十四烷酸异丙酯 3.1.5器具 无菌培养皿：（直径90mm） 无菌移液管（5ml）3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源： 菌株名称内控编号大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉编号由菌名首字母传代代数

22、制备日期组成3.1.7培养基名称生产商培养基批号配制日期有效期营养琼脂培养基改良马丁琼脂培养基3.2验证试验操作3.2.1试验菌的制备和稀释将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在3035下培养1824小时，将白色念珠菌接种至良马丁流体培养基中，2328下培养2448小时。将黑曲霉接种至改良马丁琼脂培养基中，在2328下培养57天小时。将上述培养物用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌落数为50100cfu的菌悬液。3.2.2用不同类别的微生物考察供试液及检验程序的抑菌性，将试验分为4组A样品试验组 准确取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无

23、菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇510分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：10的供试液。用移液管准确吸取1.0ml供试液至平皿中；并在每个平皿中接种50100cfu试验菌，立即倾注营养琼脂培养基，每个试验菌平行接种2个平皿，按照 平皿法测定其菌数。B菌液组 在平皿中注入1ml的菌液立即倾注营养琼脂培养基，以测定所加的菌数。C供试品对照组 取规定量的供试液，按菌落计数方法测定供试品的本底菌数。D 稀释剂对照组 取相应稀释液1ml加入试验菌，使最终菌浓度为每ml供试液含501

24、00cfu试验菌，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌落数。3.2.3培养 将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在3050下培养48小时将白色念珠菌、黑曲霉在2328下培养72小时，点计菌落数。并将结果记录于附件1。3.3试验结果3.3.1稀释剂对照组菌的回收率接入菌种尿素维生素E乳膏批号菌落计数（cfu/皿）回收率稀释剂对照组菌液组大肠埃希菌平均值金黄色葡萄球平均值枯草芽孢杆菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=稀释剂对照组的平均菌落数÷菌液组的平均菌落数×100%。3.3.2试验组的菌的回收率接入菌种尿素维生素E乳膏批号菌落计数（cfu/皿）

25、回收率试验组供试品对照组大肠埃希菌平均值金黄色葡萄球平均值枯草芽孢杆菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=（试验组的平均菌落数供试品对照组的平均菌落数的值）÷菌液组的平均菌落数×100%。4验证结果评价分析 质控部负责各项验证、试验结果记录，验证小组根据验证、试验结果进行评价（附件2），起草验证报告（附件3），报验证委员会。（附件4）验证委员会负责对验证结果进行综合评审，做出验证结论，发放验证证书（附件5）。对验证结果的评审应包括：验证试验是否有遗漏？验证实施过程中对验证方案有无修改？修改原因、依据以及是否经过批准？验证记录是否完整？验证试验结果是否符合标准要求

26、？偏差及对偏差的说明合理？是否需进一步补充试验？5附件附件1产品试验组的微生物生长检查记录：菌种名称产品试验组计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉供试品对照组的微生物生长检查记录菌种名称供试品对照组计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉稀释剂照组的微生物生长检查记录菌种名称阳性对照计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉菌液组菌种名称阳性对照计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉测试人/测试日期： 复核人/复核日期：附件2验证结

27、果评价表验证名称微生物限度检查方法（平皿法）验证编号VF-PR-17-A验证结果评价及建议确认验证小组： 年 月 日附件3验证报告年 月 日至 年 月 日，验证小组根据批准的编号为“VF-PR-17-A”的微生物限度检查方法（平皿法）验证文件对微生物限度检查法进行了相关的一系列验证工作，达到了预期效果，滋将有关事项说明如下：验证方案在实施过程中未做修改；验证方案各项性能指标在验证中未作变动，误差在允许范围内；验证过程中结果符合规定要求，记录完整属实；验证结果符合设计要求和GMP原则要求，可以投入使用。以上情况，请验证委员会审批！ 验证小组 年 月 日附件4试验报告审批表验证名称微生物限度检查方

28、法（平皿法）验证编号VF-PR-17-A验证内容审阅会签质量部审核人： 年 月 日验证委员会意见： 批准人： 年 月 日附件5上海安都药业有限公司验 证 格 证 书 编号：VF2005017项目名称：微生物限度检查方法（平皿法）验证根据我国药品GMP规范要求，依据我厂验证管理制度，经对该项目进行验证，结果符合要求。 特发此证。有效期：自 年 月 日至 年 月 日签发人： 年 月 日微生物限度检查法验证方案目 录适用范围目的概述验证所需要的仪器设备及文件可接受的限度范围标准测试方法异常情况处理测试结果结论再验证周期 11附表*; 海量资料 超值下载1适用范围本验证方案适用于*微生物限度检查法的验

29、证。2目的建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的完整性，保证检验结果的可靠性。3概述3.1*处方中含有XXXX以及常用辅料等成分，文献报道XXXX有抑菌活性。根据以上特点，按中国药典2010年版附录 J微生物限度检查法方法的“供试品的制备”项下需用特殊方法制备供试液中（6）制备供试液。“细菌，霉菌，酵母菌计数”项下检查法2薄膜过滤法进行细菌，霉菌及酵母菌的计数方法验证，控制菌检查项下控制菌的检查法验证。3.2验证时间：*批平行三次试验。4验证所需要的仪器设备及文件4.1验证需用仪器设备器具名称规格型号检定日期检定单位有效期电热恒温培养箱HG101-3多用生化培养箱

30、SP-80蒸汽灭菌器ZDX-35B4.2验证所需要的文件及存放地方资料名称存放地点HG101-3电热恒温培养箱操作维护保养SOPSP-80型生化培养箱操作维护保养SOPZDX-35B蒸汽灭菌器操作维护保养SOP微生物限度检查法SOP5可接受的限度范围标准5.1*微生物限度检查质量标准项目标准规定细菌总数1000个/g霉菌、酵母菌100个/g大肠埃希菌不得检出5.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌；若任一次试验中实验组的菌回收率低于70%，

31、应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。5.3控制菌检查方法验证结果判断若试验组检出试验菌（检出试验菌判断如下），按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。5.4大肠埃希菌检查结果判断如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯培养基的平板上，培养1824h。琼脂判供试品检出大肠埃希菌；若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表

32、所列的菌落形态特征不符，判定供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与下表所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润6测试方法6.1供试品*，批号(*)。6.2培养基及菌种6.2.1采用符合中国药典规定的干燥培养基，中国药品生物制品检定所制。6.2.2枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63501、金黄色葡萄球菌CMCC

33、(B) 26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC (F) 98001、 黑曲霉CMCC(F)98003。6.3菌液制备6.3.1细菌、霉菌及酵母菌的检查的菌液制备6.3.1.1取新鲜的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，经32.5±2.5培养1824h，用0.9无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。6.3.1.2取新鲜的白色念珠菌的培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，经25.5±2.5培养2448h，用0.9无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100c

34、fu的菌悬液，做活菌计数备用。6.3.1.3取新鲜的黑曲霉培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基，经25.5±2.5培养57d，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9无菌氯化钠溶液，将霉菌孢子洗脱。然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。6.3.2控制菌的检查菌液的制备取新鲜的大肠埃希菌的培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，经32.5±2.5培养1824h，用0.9无菌氯化钠溶液制成每

35、1ml含细菌数约为10100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。6.3.3供试品制备取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液。6.4验证试验方法: 细菌、霉菌及酵母菌检验方法验证采用上述供试品，进行3次平行试验，分别人工污染上述5种代表试验菌株。控制菌检验方法验证采用上述批供试品进行实验。6.4.1细菌、霉菌及酵母菌的计数方法验证试验6.4.1.1试验分组6.4.1.1.1供试品对照组：取上述供试液1ml，按菌落计数方法测定供试品本底细菌数；取上述供试液1ml，按菌落计数方法测定供试品本底霉菌和酵母菌数；6.4.1.1.2菌液组：分别取上述5种试验菌悬

36、液1ml，制备滤膜，按菌落计数方法测定所加的试验菌数。6.4.1.1.3试验组：取1：10供试液1ml，过滤，冲洗，分别在最后一次的冲洗液中加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液各1ml，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。取1：10供试液1ml，过滤，冲洗，分别在最后一次的冲洗液中加入白色念珠菌和黑曲霉悬液各1ml，过滤，按薄膜过滤法测定霉菌数。6.4.1.1.4稀释剂对照组：取实验用的稀释液1ml代替供试品，加入实验菌，制备滤膜，按菌落计数方法测定所加的试验菌数。6.4.1.2验证试验操作6.4.1.2.1取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：

37、10的供试液。取上述供试液1ml，加至适量稀释剂中，混匀，过滤，用pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜,冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。6.4.1.2.2阴性对照试验取实验用的稀释液1ml，制备滤膜，滤膜菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养，每种培养基至少制备一张滤膜，均不得有菌生长。6.4.1.2.3培养和计数 细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至57天进行菌落计数报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点

38、计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级别两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。一般营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌，玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌，细菌菌落数。然后将营养琼脂上的霉菌和酵母菌或玫瑰红钠琼脂培养基上细菌数与玫瑰红钠琼脂培养基上的霉菌和酵母菌或营养琼脂培养基上的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌落数为计数结果。6.4.1.3菌数报告规则以相当于1g供试品的菌落

39、数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以<1报告菌数，或<1乘以稀释倍数的值报告菌落数。6.4.1.4计算公式试 验组的菌回 收率 % 6.4.2控制菌的检查验证试验6.4.2.1试验分组6.2.2.1.1试验组取1：10供试液10ml，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入大肠埃希菌试验菌悬液1ml，过滤，滤膜接种至100ml的胆盐乳糖培养基中。6.2.2.1.2供试品组取1：10供试液10ml，制备滤膜，滤膜接种至100ml的胆盐乳糖培养基中。6.4.2.2阳性对照试验取大肠埃希菌悬液1ml，同供试品的控制菌检查法检查。阳性对照试验应检出大肠埃希菌。6.4.2.3阴性对照试验取稀释液1

40、0ml，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。6.4.2.4大肠埃希菌的试验取供试液10 ml（相当于供试品1g），制备滤膜，滤膜接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳酸培养基中，3035培养1824小时，必要时可延长至48h。取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管中，培养，于5h、24h在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作为本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。7异常情况

41、处理严格按照微生物限度检查法SOP操作，如在检测中出现不符合要求的情况出现，分析问题原因后，决定是否需对本方案中设定的*的微生物限度检查方法进行修改，并重新进行验证。8测试结果8.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果见附表1。8.2控制菌的检查方法验证结果见附表2。8.3按确定的验证方法检验三批产品微生物限度检查结果见附表3。9结论9.1按照*检验操作规程，我们设定了该产品的微生物限度检验方法，对*批*进行了微生物方法学验证，结果各项指标 标准规定，证明该标准操作规程 检验需要， GMP要求， 使用。9.2通过*的检验，各项指标的回收率均大于70%，说明*用薄膜过滤法检验无抑菌性，故适用于*的

42、微生物的检验。确定*微生物限度检查法如下： 质量负责人： 审核人： 检验人10再验证周期10.1*的处方发生变动或其它因素变更导致*的物料性质改变时，需要对本方案进行调整后作方法学再验证。10.2国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行再验证。11附表附表1 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果 试验分类实验次数大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉菌试验组123菌液组123稀释剂对照组123供试品对照组1供试品对照组2供试品对照组3阴性对照组1阴性对照组2阴性对照组3稀释剂对照组菌回收率223试验组的菌回收率123结果判定备注：*验证一批平行三次，批号：*结论：按照*微生物限度检查法验证方案检验，结果实验日期： 报告日期： 检 验 人： 复 核 人： 质量部QA: 统计日期： 附表2：控制菌检查方法的验证结果品名： 批号： 试验次数项目BL增菌液MUG靛基质检查结果结果判定第一次供试品试验组阳性对照阴性对照第二次供试品试验组阳性对照阴性对照第三次供试品试验组阳性对照阴性对照检 验 人： 复 核 人： 质量部QA: 统计日期： 附表3：按确定的验证方法检验三批产品微生物限度检查结果 品名： 项目 细菌数霉菌和酵母菌数大肠埃希菌批号cfu/gcfu/gcfu/gcfu/gcfu/gcfu/g