单克隆抗体和基因工程抗体的制备PPT精选文档

1、第四章第四章 单克隆抗体与基因单克隆抗体与基因 工程抗体的制备技术工程抗体的制备技术 李闻文李闻文 2013 ,10 中南大学湘雅医学院检验系中南大学湘雅医学院检验系 临床微生物学免疫学教研室临床微生物学免疫学教研室目的要求目的要求1. 掌握杂交瘤技术的基本原理掌握杂交瘤技术的基本原理2. 熟悉单克隆抗体的制备技术熟悉单克隆抗体的制备技术3. 熟悉基因工程抗体技术熟悉基因工程抗体技术 大多数抗原分子具有多个抗原决定大多数抗原分子具有多个抗原决定簇（表位，簇（表位，epitope）。一个抗原决定）。一个抗原决定簇刺激一个簇刺激一个B细胞克隆产生一种特异性细胞克隆产生一种特异性抗体，一种抗原刺激机

2、体产生多种抗抗体，一种抗原刺激机体产生多种抗体称为多克隆抗体（体称为多克隆抗体（polyclonal antibody ,PcAb）如免疫血清。由一个）如免疫血清。由一个只识别一种抗原表位的只识别一种抗原表位的B细胞克隆产生细胞克隆产生的同源抗体称为单克隆抗体的同源抗体称为单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)。概概 述述 单克隆抗体理化性状高度均一，其抗原单克隆抗体理化性状高度均一，其抗原结合部位完全相同，生物活性专一，特异性结合部位完全相同，生物活性专一，特异性强，纯度高，效价高，易于实验标准化及大强，纯度高，效价高，易于实验标准化及大量制备，是研究抗体的一重大突破

3、。应用比量制备，是研究抗体的一重大突破。应用比较广，如试剂诊断盒、治疗肿瘤、器官移植较广，如试剂诊断盒、治疗肿瘤、器官移植及自身免疫病等。及自身免疫病等。 第一节第一节 杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理 基本原理是融合的两种细胞保持基本原理是融合的两种细胞保持自身的特性，产生具有原来两个细自身的特性，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞称为杂交胞基因信息的单个核细胞称为杂交细胞。包括细胞。包括B细胞、细胞、T细胞，前者产细胞，前者产生生Ig，后者产生，后者产生CK。 一、B 淋巴细胞杂交瘤技术 细胞是经抗原免疫的小鼠脾细胞和细胞是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。小鼠骨髓瘤细

4、胞。B B细胞能产生抗体，细胞能产生抗体，但不能在体外长期生长，而骨髓瘤细胞但不能在体外长期生长，而骨髓瘤细胞不产生抗体但在体外能长期生长，二者不产生抗体但在体外能长期生长，二者融合，各保持其本性，既产生抗体又长融合，各保持其本性，既产生抗体又长期生长。期生长。 其原理分为几个步骤其原理分为几个步骤 目的是制备抗原特异的目的是制备抗原特异的 McAbMcAb，所，所以融合的细胞必须经抗原免疫的以融合的细胞必须经抗原免疫的B B细胞，细胞，通常取脾，另一是在体外长期生长又通常取脾，另一是在体外长期生长又不产生抗体，所以选肿瘤细胞即多发不产生抗体，所以选肿瘤细胞即多发性骨髓瘤细胞，具备以下特点：性

5、骨髓瘤细胞，具备以下特点： （一）细胞的选择与融合 1. 1. 稳定、易培养稳定、易培养 2. 2. 自身不分泌自身不分泌IgIg或或CKCK 3. 3. 融合率高融合率高 4. 4. 是是HGPRTHGPRT缺陷株缺陷株 目前常用的目前常用的BALB/cBALB/c小鼠小鼠B B细胞瘤株有细胞瘤株有P3-P3-X63-Ag8.653CX63-Ag8.653C（P3.653P3.653）、）、Sp2/0Sp2/0等。为等。为HATHAT敏感株，易培养敏感株，易培养, , 融合率高，最常选用融合率高，最常选用聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)使细胞膜轻度损伤，细胞容使细胞膜轻度损伤，细胞容易融

6、合。易融合。 （二）选择培养基的应用（二）选择培养基的应用 细胞融合是一个随机的物理过程。融合后可细胞融合是一个随机的物理过程。融合后可能出现以下情况能出现以下情况: : 1 1）脾细胞与瘤细胞）脾细胞与瘤细胞 2 2）瘤细胞与瘤细胞）瘤细胞与瘤细胞 3 3）脾细胞与脾细胞）脾细胞与脾细胞 4 4）未融合的脾细胞）未融合的脾细胞 5 5）未融合的瘤细胞）未融合的瘤细胞 6 6）多聚体形式。）多聚体形式。 3 3）、）、4 4）、）、6 6）在体外易死去，不需筛选。）在体外易死去，不需筛选。细胞的细胞的 DNA 合成一般有两条途径合成一般有两条途径 一是糖和氨基酸及其他小分子化合物一是糖和氨基酸

7、及其他小分子化合物合成核苷酸，进一步合成合成核苷酸，进一步合成 DNA，叶酸是，叶酸是重要辅酶。重要辅酶。 一是辅助途径，是在次黄嘌呤和胸腺一是辅助途径，是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶嘧啶存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（hypoxanthine guanine hypoxanthine guanine phospheribosyl transferase,HGPRTphospheribosyl transferase,HGPRT）和）和胸腺嘧啶核苷激酶（胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine thymidine kinase,TKkinase,TK）的催化作用）的催化作

8、用合成合成 DNA。 氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，当氨基蝶氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，当氨基蝶呤存在时，能阻断第一条途径。细胞融合呤存在时，能阻断第一条途径。细胞融合的选择培养基中有三种关键成分，次黄嘌的选择培养基中有三种关键成分，次黄嘌呤呤(hypoxanthine,H)(hypoxanthine,H)、氨基蝶呤、氨基蝶呤(aminopoterin,A)(aminopoterin,A)、胸腺嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)(thymidine,T)，三者取前缀缩写为，三者取前缀缩写为 HAT HAT 培养基，其融合细胞所用的瘤细胞是经毒培养基，其融合细胞所用的瘤细胞是经毒性培养基选择

9、出来的性培养基选择出来的 HGPRT HGPRT 阴性细胞株。阴性细胞株。 所以，前面提到的所以，前面提到的 2）瘤细胞与瘤细）瘤细胞与瘤细胞及胞及 5) 未融合的瘤细胞不能生长，只有未融合的瘤细胞不能生长，只有 1）脾细胞与瘤细胞才能生长，因为脾细胞为脾细胞与瘤细胞才能生长，因为脾细胞为 HGPRT 阳性，通过补偿途径代替氨基蝶呤阳性，通过补偿途径代替氨基蝶呤阻断的主要途径。阻断的主要途径。 （三）有限稀释与抗原特异性选择（三）有限稀释与抗原特异性选择 在免疫动物时，一种抗原往往有多个表在免疫动物时，一种抗原往往有多个表位位 ，一个，一个B B细胞克隆接受一个表位，故在细胞克隆接受一个表位，

10、故在免疫动物时是众多免疫动物时是众多 B B 细胞克隆的抗体的分细胞克隆的抗体的分泌，而针对目的抗原的泌，而针对目的抗原的B B细胞只占很少部分细胞只占很少部分，在细胞融合后，有相当一部分是无关的，在细胞融合后，有相当一部分是无关的细胞融合体，即融合细胞分泌的不是目的细胞融合体，即融合细胞分泌的不是目的抗体，要进行筛选，分二步稀释。抗体，要进行筛选，分二步稀释。 计数，每个孔只放一个细胞，实际是计数，每个孔只放一个细胞，实际是0至数个，整个过程为克隆化，将阳性细胞至数个，整个过程为克隆化，将阳性细胞株重复一次，尽量使抗体更纯，将阳性细株重复一次，尽量使抗体更纯，将阳性细胞进行增殖，部分冻存，部

11、分进行体外培胞进行增殖，部分冻存，部分进行体外培养或动物接种。养或动物接种。 另外还有其他杂交瘤技术，如人另外还有其他杂交瘤技术，如人- -人人 B B 淋巴细胞杂交瘤和鼠淋巴细胞杂交瘤和鼠- -人人 B B 淋巴细胞杂淋巴细胞杂交瘤，人骨髓瘤细胞系体外建株比较困难，交瘤，人骨髓瘤细胞系体外建株比较困难，生长不稳定，有的分泌生长不稳定，有的分泌 IgEIgE，有的分泌，有的分泌 Ig Ig 的的、链。链。B B细胞取外周血淋巴细胞、细胞取外周血淋巴细胞、脾细胞、淋巴结细胞、病灶浸润性淋巴细脾细胞、淋巴结细胞、病灶浸润性淋巴细胞。从理论上讲很好，但实际比较困难，胞。从理论上讲很好，但实际比较困难

12、，在于缺乏好的亲体骨髓瘤细胞株，较难获在于缺乏好的亲体骨髓瘤细胞株，较难获得抗原特异性得抗原特异性B B淋巴细胞；人杂交瘤细胞淋巴细胞；人杂交瘤细胞不能在小鼠或其他动物体内生长。不能在小鼠或其他动物体内生长。 小鼠骨髓瘤与人的小鼠骨髓瘤与人的B细胞杂交瘤，该技细胞杂交瘤，该技术优点是易获得小鼠骨髓瘤细胞，融合率术优点是易获得小鼠骨髓瘤细胞，融合率较高，但最大的缺点是不同种杂交后不稳较高，但最大的缺点是不同种杂交后不稳定，杂交瘤传代后，很快丧失分泌抗体的定，杂交瘤传代后，很快丧失分泌抗体的染色体。染色体。二、二、T 细胞杂交瘤细胞杂交瘤 自自 B B 细胞杂交瘤技术后，细胞杂交瘤技术后，T T

13、淋巴细胞淋巴细胞杂交瘤成为热门，为获得淋巴因子，更深杂交瘤成为热门，为获得淋巴因子，更深入地研究入地研究T T细胞的各种功能，虽然有一些小细胞的各种功能，虽然有一些小鼠鼠T T细胞杂交瘤成功的报道，但结果不满意，细胞杂交瘤成功的报道，但结果不满意，该细胞很不稳定，分泌淋巴因子无特异性，该细胞很不稳定，分泌淋巴因子无特异性，一种一种T T细胞杂交瘤可同时分泌几种淋巴因子，细胞杂交瘤可同时分泌几种淋巴因子，到目前仍无突破性进展。到目前仍无突破性进展。 T T 淋巴细胞杂交瘤分为小鼠及人，淋巴细胞杂交瘤分为小鼠及人，由于由于 T T 细胞功能的多样化，制备出的细胞功能的多样化，制备出的 T T 细胞

14、杂交瘤也各有其特性，如分泌淋细胞杂交瘤也各有其特性，如分泌淋巴因子，特异性杀伤功能，分泌抑制因巴因子，特异性杀伤功能，分泌抑制因子，自身反应性等。其基本过程是将激子，自身反应性等。其基本过程是将激活的活的T T细胞与酶缺陷型细胞与酶缺陷型T T淋巴细胞瘤细胞淋巴细胞瘤细胞融合，可表达特异性融合，可表达特异性 TCR TCR 或其他功能或其他功能的杂交瘤的杂交瘤T T细胞，与细胞，与 B B 细胞相以，但细细胞相以，但细胞激活和阳性克隆筛选较为杂交，不稳胞激活和阳性克隆筛选较为杂交，不稳定，简介主要步骤定，简介主要步骤 。1. 1. 淋巴瘤细胞系的选择淋巴瘤细胞系的选择1 1）体外无限制快速生长

15、）体外无限制快速生长2 2）融合率高）融合率高3 3）不分泌淋巴因子和杀伤功能）不分泌淋巴因子和杀伤功能4 4）缺乏某一特异性表面抗原或受体）缺乏某一特异性表面抗原或受体5 5）HGPRT HGPRT 酶缺陷型酶缺陷型 2.2.特异性特异性T T细胞的制备与纯化主要有细胞的制备与纯化主要有可溶性抗原诱导激活的可溶性抗原诱导激活的 T T 细胞、同种反细胞、同种反应性应性T T 细胞、人的特异性细胞、人的特异性 T T 细胞。细胞。 3.T 3.T 细胞杂交瘤的筛选细胞杂交瘤的筛选 通常在含有通常在含有HATHAT选择培养基上，选择培养基上，用特异性抗体筛选产生淋巴因子的用特异性抗体筛选产生淋巴

16、因子的杂交瘤细胞，用抗杂交瘤细胞，用抗 CD3-TCR CD3-TCR 抗体筛抗体筛选阳性细胞。选阳性细胞。 三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养 杂交瘤细胞形成的初期很不稳定，杂交瘤细胞形成的初期很不稳定，鼠的二倍体细胞有鼠的二倍体细胞有4040对染色体，杂交后对染色体，杂交后8080对，易丢失，丢失后仍生长，要检测对，易丢失，丢失后仍生长，要检测上清液中是否有目的抗体及淋巴因子。上清液中是否有目的抗体及淋巴因子。 将阳性细胞进行单细胞培养，反复将阳性细胞进行单细胞培养，反复23次，确保为一单细胞阳性杂交瘤细胞应及次，确保为一单细胞阳性杂交瘤细胞应及时冻存，以防止细胞

17、染色体丢失，发生变时冻存，以防止细胞染色体丢失，发生变异或污染，冻存于液氮（异或污染，冻存于液氮（-196）,冻存时冻存时加小牛血清至加小牛血清至20%, 加几滴加几滴10%二甲亚砜。二甲亚砜。 杂交瘤细胞培养可用液体、半固体、杂交瘤细胞培养可用液体、半固体、接种动物腹腔。接种动物腹腔。第二节第二节 单克隆抗体的制备技术单克隆抗体的制备技术 McAb McAb 单一、特异、纯化，利用杂交单一、特异、纯化，利用杂交瘤技术制备瘤技术制备McAbMcAb的基本原理是三个原则：的基本原理是三个原则： 1 1）一种单克隆产生一种抗体）一种单克隆产生一种抗体 2 2）杂交瘤细胞保持双亲细胞特性）杂交瘤细胞

18、保持双亲细胞特性 3 3）筛选培养基）筛选培养基 一、单克隆抗体的产生一、单克隆抗体的产生 1. 1. 动物体内生长动物体内生长 杂交瘤细胞注射同系小鼠腹腔，先杂交瘤细胞注射同系小鼠腹腔，先注射石蜡或不完全佐剂，使腹腔渗出液注射石蜡或不完全佐剂，使腹腔渗出液增多，增多，1 12 2周后无菌方法抽取腹水，离周后无菌方法抽取腹水，离心取上清。心取上清。 2. 2. 体外培养体外培养 较常做，用普通培养瓶培养，根据培较常做，用普通培养瓶培养，根据培养时间、细胞生长情况收取上清液。另有养时间、细胞生长情况收取上清液。另有高密度培养，在单位体积内增加细胞的培高密度培养，在单位体积内增加细胞的培养数量。养

19、数量。 二、单克隆抗体的纯化二、单克隆抗体的纯化 腹水或细胞上清液，均含有脂蛋白、脂腹水或细胞上清液，均含有脂蛋白、脂质及细胞碎片等杂质，用滤纸去掉脂质和大质及细胞碎片等杂质，用滤纸去掉脂质和大颗粒，离心去除细胞碎片和蛋白聚合物。颗粒，离心去除细胞碎片和蛋白聚合物。 目前纯化方法有十几种，一般采用盐目前纯化方法有十几种，一般采用盐析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取等，现在最有效的方法是亲和纯化法，常等，现在最有效的方法是亲和纯化法，常用用 SPA 或抗小鼠免疫球蛋白抗体与载体交或抗小鼠免疫球蛋白抗体与载体交联。称为联。称为 Sepharose 柱，抗体结合

20、上去，然柱，抗体结合上去，然后洗脱。后洗脱。 三、单克隆抗体的性质鉴定三、单克隆抗体的性质鉴定 鉴定的方法很多，用已知抗原测鉴定的方法很多，用已知抗原测定抗体，几乎所有的抗原抗体反应定抗体，几乎所有的抗原抗体反应试验都可以作，如阳性，再定量，试验都可以作，如阳性，再定量，确定工作浓度。确定工作浓度。 第三节第三节 基因工程抗体技术基因工程抗体技术 杂交瘤单克隆抗体在诊断、治疗、杂交瘤单克隆抗体在诊断、治疗、预防和蛋白质提纯应用中非常广泛，预防和蛋白质提纯应用中非常广泛，但对人是异源性，人抗小鼠抗体，但对人是异源性，人抗小鼠抗体，应用基因工程技术减少小鼠源成分，应用基因工程技术减少小鼠源成分，保

21、留原有的抗体特异性。保留原有的抗体特异性。一、人源化抗体一、人源化抗体 人源化抗体主要指鼠源性单克隆抗人源化抗体主要指鼠源性单克隆抗体的基因克隆及体的基因克隆及 DNA DNA 重组技术改造，重组技术改造，重新表达的抗体。其大部分氨基酸序列重新表达的抗体。其大部分氨基酸序列为人源序列所取代，既基本保留亲代鼠为人源序列所取代，既基本保留亲代鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了鼠异源性。了鼠异源性。 （一）人（一）人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体 通过基因工程技术将人通过基因工程技术将人 IgG C IgG C 区与区与鼠鼠IgG V IgG V 区连接，导入细胞内表达

22、制备的抗区连接，导入细胞内表达制备的抗体称为嵌合抗体，因体称为嵌合抗体，因 IgG IgG 的抗原性在的抗原性在 C C 区，区，来自人，故抗原性降低，且半衰期明显延长，来自人，故抗原性降低，且半衰期明显延长，在介导在介导 CDC CDC 及及 ADCC ADCC 亦明显增强。亦明显增强。 1.1.鼠单克隆抗体可变区基因克隆鼠单克隆抗体可变区基因克隆 用探针从该杂交瘤细胞的基因组文用探针从该杂交瘤细胞的基因组文库中调取。用库中调取。用 PCR PCR 方法从该细胞的方法从该细胞的 RNA RNA 中扩增中扩增 V VH H 及及 V VL L 基因。基因。 2. 2. 表达载体的构建表达载体的

23、构建 人人- -鼠嵌合抗体的表达载体基因依可变区鼠嵌合抗体的表达载体基因依可变区基因克隆的表达方式不同而分为两类，从基因基因克隆的表达方式不同而分为两类，从基因文库所克隆的可变区基因带有上游的转录调控文库所克隆的可变区基因带有上游的转录调控组件及内含子剪接信号，因此载体只需要包括组件及内含子剪接信号，因此载体只需要包括细胞内增殖所必须的抗生素抗性基因和质粒复细胞内增殖所必须的抗生素抗性基因和质粒复制的起始序列以及在真核细胞进行选择的显性制的起始序列以及在真核细胞进行选择的显性标记基因。标记基因。 将载体将载体 DNA DNA 导入真核细胞称为转染。导入真核细胞称为转染。导入的导入的 DNA D

24、NA 整合至细胞基因组整合至细胞基因组 DNA DNA 中中得到转染子，要得到稳定的转染子需利得到转染子，要得到稳定的转染子需利用真核细胞的显性选择标记基因，这些用真核细胞的显性选择标记基因，这些标记基因使细胞获得对某些细胞毒物质标记基因使细胞获得对某些细胞毒物质的抗体，在培养液中加入相应的细胞毒的抗体，在培养液中加入相应的细胞毒物质可杀死转染不成功的细胞，达到选物质可杀死转染不成功的细胞，达到选择的目的。择的目的。 3.3.表达表达 用哺乳动物细胞或大肠杆菌表达量较少，用哺乳动物细胞或大肠杆菌表达量较少，而应用二氢叶酸还原酶（而应用二氢叶酸还原酶（dhfrdhfr）扩增系统使抗）扩增系统使抗

25、体表达增强。体表达增强。dhfr dhfr 是正常核酸代谢必须的酶，是正常核酸代谢必须的酶，缺乏该酶的中华仓鼠卵细胞（缺乏该酶的中华仓鼠卵细胞（ CHOCHO）需在有）需在有次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷条件下利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷条件下利用 DNA DNA 合成，合成，因此因此, dhfr , dhfr 作作 CHO CHO 的显性选择标记基因，在的显性选择标记基因，在无次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷的情况下，只有导无次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷的情况下，只有导入入 dhfr dhfr 基因，细胞才能存活。该糸统可用来基因，细胞才能存活。该糸统可用来扩增导入的目的基因。扩增导入的目的基因。 ( ( 二二 )

26、) 改 形 抗 体 （改 形 抗 体 （ r e s h a p e d r e s h a p e d antibody,RABantibody,RAB） 应用基因工程技术在嵌合抗体基础应用基因工程技术在嵌合抗体基础上用人抗体可变区序列取代鼠源单抗上用人抗体可变区序列取代鼠源单抗CDRCDR以外的骨架序列，重新构成既有鼠源单以外的骨架序列，重新构成既有鼠源单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体，该抗体对人无免疫原性。抗体，该抗体对人无免疫原性。 （三）抗体的表面修饰（三）抗体的表面修饰 人和鼠人和鼠 IgVIgV区来自不同的种属，轻链不同型区来自不同的种属

27、，轻链不同型别 ， 互 补 性 决 定 区别 ， 互 补 性 决 定 区 ( c o m p l e m e n t a r i t y ( c o m p l e m e n t a r i t y determining region,CDR) determining region,CDR) 的长度可不一致，的长度可不一致，但暴露于表面的但暴露于表面的AAAA残基的位置数量都很保守，残基的位置数量都很保守，通过改变表面残基使其人源化，降低鼠可变区的通过改变表面残基使其人源化，降低鼠可变区的异源性，将异源性，将FvFv的表面人源化，消除其免疫原性的表面人源化，消除其免疫原性而不影响而不影响

28、FvFv 的整体空间构象。的整体空间构象。 （四）双特异性抗体（四）双特异性抗体 双特异性抗体（双特异性抗体（bispecific bispecific antibody,BsAbantibody,BsAb）又称双功能抗体。两个抗）又称双功能抗体。两个抗原结合部位具有不同的特异性，可以同时原结合部位具有不同的特异性，可以同时与两种不同特异性抗原发生结合。与两种不同特异性抗原发生结合。 1.1.化学交联化学交联BsAbBsAb 分别分离纯化两种抗原的单抗，先使分别分离纯化两种抗原的单抗，先使IgIg解离后，获得单价抗体，再使两种不同解离后，获得单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体或其片段交

29、联起来抗原特异性的单价抗体或其片段交联起来。该方法易致抗体失活，其产物也难以保。该方法易致抗体失活，其产物也难以保证均质性。证均质性。 2.2.细胞工程细胞工程BsAbBsAb 将二种杂交瘤细胞进行融合产生杂交将二种杂交瘤细胞进行融合产生杂交瘤，核酸随机组合多种多样。瘤，核酸随机组合多种多样。 3.3.基因工程基因工程BsAbBsAb 用抗体分子片段如用抗体分子片段如ScFvScFv或或FabFab等，经基等，经基因操作修饰后，或体外组装成为因操作修饰后，或体外组装成为BsAbBsAb，或，或直接导入受体细胞表达分泌直接导入受体细胞表达分泌BsAbBsAb。 在免疫检测、肿瘤放射免疫显象、药在

30、免疫检测、肿瘤放射免疫显象、药物刹伤、介导细胞刹伤效应起重要作用。物刹伤、介导细胞刹伤效应起重要作用。 二、小分子抗体二、小分子抗体 具有结合抗原功能的分子片段称为小具有结合抗原功能的分子片段称为小分子抗体。其优点：分子抗体。其优点：1 1）可在原核细胞表）可在原核细胞表达，生产成本低达，生产成本低; 2; 2）易于穿透血管或组）易于穿透血管或组织到靶细胞部位，有利于疾病的治疗；织到靶细胞部位，有利于疾病的治疗；3 3）不含不含Fc Fc 段，副作用小；段，副作用小；4 4）半衰期短，有）半衰期短，有利于毒素中和及清除。利于毒素中和及清除。 小分子抗体包括：抗原结合片段小分子抗体包括：抗原结合

31、片段（fragment of antigen binding,Fabfragment of antigen binding,Fab），），可变区片段（可变区片段（fragment of variable fragment of variable region,Fvregion,Fv）, ,单链抗体（单链抗体（single chain single chain Fv,ScFvFv,ScFv），单区抗体。另有），单区抗体。另有V VH H和和V VL。 1. Fab 由一条完整的由一条完整的 L L 链和约为链和约为1/21/2的的 H H 链组成，是完整抗体的链组成，是完整抗体的 1/31/3，

32、只有一个，只有一个Ag Ag 结合位点，它是将结合位点，它是将 McAb McAb 重链重链V V区和区和 C CH H1 1 区区cDNA cDNA 与完整轻链与完整轻链 cDNA cDNA 连接，在连接，在细胞启动子的控制下分泌表达。细胞启动子的控制下分泌表达。 2. Fv2. Fv和单链抗体（和单链抗体（ScFvScFv） Fv Fv 由由 V VH H 和和 V VL L 构成，非共价键结合，为完构成，非共价键结合，为完整抗体的整抗体的1/61/6，单一抗原结合位点，单一抗原结合位点，V VH H和和V VL L连接有连接有三种方法：三种方法：1 1）用戊二醛处理，使之交联；）用戊二醛

33、处理，使之交联；2 2）引）引入半胱氨酸残基，使入半胱氨酸残基，使V VH H和和V VL L之间形成二硫键；之间形成二硫键；3 3）把把V VH H和和V VL L用一段适当的寡核苷酸分子连接起来，用一段适当的寡核苷酸分子连接起来，表达成一个单链，称为表达成一个单链，称为ScFvScFv。 3. 3. 单区抗体及最小识别单位单区抗体及最小识别单位 根据抗体分子的结构，一般将根据抗体分子的结构，一般将 FvFv 称为抗称为抗体的最小单位，但有些更小亚单位仍结合抗原，体的最小单位，但有些更小亚单位仍结合抗原，如单独重链如单独重链 V VH H 仍可保留相当程度抗原结合能力，仍可保留相当程度抗原结

34、合能力，其作用比其作用比 V VL L 大，称为单区抗体（大，称为单区抗体（single single domain antibodydomain antibody），其亲和力低于完整的），其亲和力低于完整的 FvFv，因单区抗体的疏水区的暴露，增加了非特异性因单区抗体的疏水区的暴露，增加了非特异性吸附，水溶性减低，其应用受到限制，但分子吸附，水溶性减低，其应用受到限制，但分子量小，单位体积浓度高，副作用小，是很有前量小，单位体积浓度高，副作用小，是很有前景的抗体部分。景的抗体部分。 将抗体分子片段与其他蛋白融合，将抗体分子片段与其他蛋白融合，可得到有多样性生物功能的融合蛋白，可得到有多样性生

35、物功能的融合蛋白，有几种构建方式：有几种构建方式： 1 1）将）将 Fab Fab 或或 ScFvScFv与其他生物活与其他生物活性蛋白融合，建成生物导弹。性蛋白融合，建成生物导弹。 三、抗体融合蛋白三、抗体融合蛋白 2）在融合时可根据某些恒定区，可使）在融合时可根据某些恒定区，可使某些生物活性与抗体的生物学效应功能联某些生物活性与抗体的生物学效应功能联结在一起。结在一起。 3）将）将 ScFv 与某些细胞膜蛋白融合，形与某些细胞膜蛋白融合，形成嵌合受体，使细胞结合抗原成嵌合受体，使细胞结合抗原 。 （一）含（一）含FvFv片段的抗体融合蛋白片段的抗体融合蛋白 将将 FvFv 与某些毒素、酶及

36、细胞因与某些毒素、酶及细胞因子等的基因连接，能编码子等的基因连接，能编码 FvFv 与毒素、与毒素、酶及细胞因子复合物，即生物导弹，酶及细胞因子复合物，即生物导弹，主要在于抗肿瘤。主要在于抗肿瘤。 （二）嵌合受体（二）嵌合受体 将将ScFv ScFv 与某些细胞膜蛋白分子融合，形与某些细胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白可表达于细胞表面。其抗体部成的融合蛋白可表达于细胞表面。其抗体部分与相应抗原特异性结合。如将抗体的可变分与相应抗原特异性结合。如将抗体的可变区基因与区基因与TCRTCR的的链和链和链恒定区融合，将融链恒定区融合，将融合基因导入合基因导入T T细胞，既表达特异性抗体，又表细胞，既表

37、达特异性抗体，又表达达TCRTCR，该，该TCRTCR不受不受MHCMHC分子限制。分子限制。 （三）含（三）含 Fc Fc 的抗体融合蛋白的抗体融合蛋白 如将如将CD4CD4分子细胞膜外部分与分子细胞膜外部分与Fc Fc 融合后用真融合后用真核细胞表达，由二硫键连接成双体，分泌到细胞外，核细胞表达，由二硫键连接成双体，分泌到细胞外，产生二种功能：产生二种功能：1 1）延长在血循环中的半衰期；）延长在血循环中的半衰期；2 2）通过功能蛋白与配体分子的作用，将通过功能蛋白与配体分子的作用，将FcFc的生物学效的生物学效应引导至特定目的，如应引导至特定目的，如CD4CD4与与FcFc融合蛋白，融合

38、蛋白，CD4CD4是是T T辅助细胞表面糖蛋白，是辅助细胞表面糖蛋白，是HIV HIV 的受体，该融合蛋白的受体，该融合蛋白能竞争结合能竞争结合 HIVHIV，可阻断，可阻断 HIV HIV 对对T TH H 的感染，可介的感染，可介导导 ADCCADCC及及CDCCDC，可通过胎盘。，可通过胎盘。 小分子抗体都是单价，不能偶联。将特异性小分子抗体都是单价，不能偶联。将特异性不同的两个小分子抗体连接在一起可获得双特不同的两个小分子抗体连接在一起可获得双特异性抗体。（异性抗体。（bispecific antibody,BsAbbispecific antibody,BsAb），），双价双价ScF

39、vScFv与抗原结合比单价敏感性高，亲和力与抗原结合比单价敏感性高，亲和力大，结构和功能上都更接近亲本抗体。大，结构和功能上都更接近亲本抗体。BsAbBsAb分分子片段可从子片段可从FabFab、FvFv 或或 ScFvScFv 组建，可在体内或组建，可在体内或体外连接。体外连接。 四、双特异性抗体四、双特异性抗体 在小分子抗体的羧基端设计半胱氨酸残基，如带在小分子抗体的羧基端设计半胱氨酸残基，如带铰链区的铰链区的 Fab 段或带半胱氨酸残基尾巴的段或带半胱氨酸残基尾巴的 ScFv，可，可在体外通过化学交联成为双价抗体分子，亮氨酸铰在体外通过化学交联成为双价抗体分子，亮氨酸铰链也可用来构建，两

40、个不同抗体连接成为功能抗体。链也可用来构建，两个不同抗体连接成为功能抗体。如抗体如抗体 CD3 和抗和抗 IL-2R的的Fab 在体外直接介导在体外直接介导T细细胞对表达胞对表达 IL-2的细胞有杀伤作用。的细胞有杀伤作用。 （一）双价抗体分子的构建（一）双价抗体分子的构建1. 体外构建体外构建 对小分子抗体基因的改造修饰，使细胞对小分子抗体基因的改造修饰，使细胞直接表达双抗体分子，比体外组建更有效，直接表达双抗体分子，比体外组建更有效，现有以下几种方法现有以下几种方法: : 2. 双抗体分子的细胞内组建双抗体分子的细胞内组建 （1）设计促进双聚体形成的结构域，半胱）设计促进双聚体形成的结构域

41、，半胱氨酸是促进双聚体形成的结构域，使小分子氨酸是促进双聚体形成的结构域，使小分子抗体在大肠杆菌的分泌型表达过程中形成双抗体在大肠杆菌的分泌型表达过程中形成双体，亮氨酸拉链和甲基（体，亮氨酸拉链和甲基（CH3）亦有螺旋）亦有螺旋转转角角螺旋结构，使之成为双体。螺旋结构，使之成为双体。 （2）在基因构建上直接将两个抗体分子片）在基因构建上直接将两个抗体分子片段融合。段融合。 （3）双体分子）双体分子 两个两个 ScFv 的的 VH 和和 VL 相相互配对，可产生双价的双抗体分子。互配对，可产生双价的双抗体分子。 能同时结合两种不同抗原，因而可介导能同时结合两种不同抗原，因而可介导标记物与靶抗原的

42、结合，或某些高级分子标记物与靶抗原的结合，或某些高级分子定位于靶细胞。在临床上有以下应用：定位于靶细胞。在临床上有以下应用： （ 二）双特异性抗体的应用二）双特异性抗体的应用 1. 在免疫检测中的应用在免疫检测中的应用 一个臂结合靶一个臂结合靶抗原，另一个臂结合酶，不需用酶标记抗体抗原，另一个臂结合酶，不需用酶标记抗体，避免在标记过程中降低酶及抗体的活性。，避免在标记过程中降低酶及抗体的活性。 2. 在肿瘤放射免疫显像中的应用在肿瘤放射免疫显像中的应用 一个一个臂结合肿瘤细胞，另一个臂结合半抗原螯合臂结合肿瘤细胞，另一个臂结合半抗原螯合剂，半抗原螯合剂能选择与放射性核素结合剂，半抗原螯合剂能选择与放射性核素结合。放射免疫显像，清晰度和灵敏度高。放射免疫显像，清晰度和灵敏度高。 3. 3. 双特异性抗体介导的药物杀伤效应双特异性抗体介导的药物杀伤效应 治疗肿瘤生