浅谈HPLC法检测咸鸭蛋中非法添加苏丹红染料

1、浅谈hplc法检测咸鸭蛋中非法添加苏丹红染料杨沫银内彖古食品药品检验所（010020）摘要：口的：完善检测方法，更好的监控非法添加物。方法：釆用高效液相色谱法，改 变提取溶剂。结果：苏丹红i、ii、iii、iv分别在0u g/ml2.56yg/ml范围呈良好线性 关系，回收率在66%80%之间，方法最低检出限在3. 3u g/kg7. 5p g/kg （按蛋总重计 算）z间。结论：方法简便，结果准确。关键词：咸鸭蛋 高效液相色谱法苏丹红abstract objective: to perfect the method of measure method, better monitoring o

2、f illegal additives. method: adopt hplc to change the solvent extraction. results: the calibration curve showed a good linearity with the range of 0|ig/ml -2.56|ig/ml for sudan , the range of recovery was 66%-80%, the limit of detection was 3.3|ig/kg-7.5|ig/kg （according to calculation of the total

3、egg）. conclusion: the methed is simple and the result is accurate.苏丹红展于化工染料，有i、ii、iil iv号四种。据文献报道，该物质具有偶氮 结构，对人体的肝、肾器官有明显的毒副作用。经毒理学研究表明，苏丹红具有致突变 性和致癌性，国家明令禁止添加丁食品中。本方法参照相关文献，将其提取方法进行 了修订，改进后的方法具有分离效果好、灵敏、准确等优点。1 样品来源：市售。2 仪器与试药：2.1仪器 美国安捷仑-1100高效液相色谱仪，紫外-可见检测器，离心机，旋转蒸 发仪等。2.2试剂乙睛、丙酗、甲酸、为色谱纯，水为重蒸水，其他

4、试剂均为分析纯。2. 3对照品 苏丹红由d-86199 augsburg, gemany提供 苏丹红i、苏丹红ii、 苏丹红iii、苏丹红iv纯度285%。2.4层析用氧化铝（中性100目200目）：105°c干燥2h,于干燥器中冷却至室温， 每100g中加入2ml水降活，混匀密封，放置12h后使用。2. 5氧化铝层析柱：在层析柱管（lcmx5cm的注射器管）底部塞入一薄层脱脂棉， 干法装入处理过的氧化铝至3cm高，轻敲实后加一薄层脱脂棉，用10ml正己烷预淋洗， 洗净柱小杂质后，备用。3. 色谱条件：3. 1 色谱柱:agilent zorbax sb- c18 3. 5um 4.

5、 6mmx 150mm3.2流动相：a： 0.1%甲酸的水溶液：乙睛（85 : 15）b： 0.1%甲酸的乙睛溶液：丙酗（80 : 20）流速：lml/mim柱温：30°c；检测波长478nm；进样量：10口1。梯度条件见表1表1梯度条件时间(min)a%流动相b%0257510.0257525.0010032.0010035.0257540.025754.方法学考察4. 1溶液制备4. 1. 1对照品溶液的制备分别精密称取苏丹红i、苏丹红ii、苏丹红iii、苏丹红 iv各lo.omg （按实际含量折算），置250ml量瓶中，加乙瞇溶适量使溶解，加正己烷稀 释至刻度,摇匀，作为标准储

6、备液。精密吸取标准储备液0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ml, 置25ml量瓶中，加丙酮稀释至刻度,即得。此标准系列浓度为0、0.16、0.32、0.64、 1.28、2.56u g/mlo4.1. 2供试品溶液的制备 称取粉碎样品2g4g （准确至o.olg）,置50ml离心管 中，加入水3m, 1匀浆lmin将其分散成糊状，加入正己烷：丙酮（311） 6ml,充分匀 浆5min, 3000rpm离心10min,吸出正己烷液,于下层再加入次正己烷（4ml、4ml）, 匀浆，离心，合并3次正己烷液，加入无水硫酸钠lg脱水，滤过，滤液置旋转蒸发仪 蒸干并保持5分钟，用正己烷溶解并缓

7、缓转移至已处理氧化铝层析柱上，用正己烷少量 多次冲洗浓缩瓶，一并注入层析柱，用40ml teci烷洗脱至流出液无色，蒸干，残渣用 丙酮适量使溶解并定容至2ml,过微孔滤膜（0.45 um）,即得。4. 2含量计算按公式（1）计算苏丹红含量cxvr = （1）mr：样品屮苏丹红含量，单位为mg/kg；c：由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度，单位为u g/ml；v：样液定容体积，单位为m 1；m：样品质量，单位为g。4. 3线性关系的考察分别精密称取苏丹红i、苏丹红ii、苏丹红iii、苏丹红iv齐10 mg （按实际含量折 算），置250ml量瓶中，加乙醯适量使溶解，加正c烷稀帑至刻度，摇匀。精密

8、吸取0ml、 0.1ml、0.2 mk 0.4 ml. 0.8 mk 1.6ml,置25ml量瓶中,加丙酮稀释至刻度,摇匀，分 别精密吸取10"进样，按上述色谱条件测定。以峰面积对进样量进行冋归分析，绘制 标准曲线。结果见表2表2标准曲线测定结果序号123456苏丹红i浓度（u g/ml）00j6080.32160.64331.28672.5735峰面积积分值平均值07.0048514.2162828.2511554.9508110.3807冋归方程（苏丹红i ）y=42.78x+0.2488r=0.9999苏丹红11浓度（ug/ml）00.16710.33420.66841.336

9、82.6736峰而积积分值平均值07.093414.1028429.9773558.42848117.8936回归方程（苏丹红ii）y=44.132x-0.1852r=0.9999苏丹红iii浓度（u g/ml）00.15990.31980.63961.27922.5585峰而积积分值平均值06.78368513.0338727.8521754.41752110.2893冋归方程（苏丹红iii）y=43.122x-0.2311r=0.9999苏丹红【v浓度（ug/ml）00j6090.32180.64361.28722.5745峰面积积分值平均值05.94661511.7610424.9113

10、48.4411799.15771冋归方程（苏丹红iv）y=38.504x-0.3077r=0.99994.4冋收率试验取已知不含添加剂的空白样品2份，分别精帑加入苏丹红对照品适量，按拟订的含量测定方法制备供试品溶液，测定每份样品中苏丹红的含量，计算回收率。结杲见表3表3回收率试验结果编号取样量（g）対照品加入量（ug）样品含量（u g）冋收率（）苏丹红i1.28670.917371.28苏丹红ii1.33680. 989073.9812.311苏丹红iii1.27920. 853666.72苏丹红iv1.28721.032680.21苏丹红i1.28670. 998277.57苏丹红ii1.3

11、3680. 968872.4722.881苏丹红iii1.27920. 888169.42苏丹红iv1.28721.00577&134. 5方法最低检出限试验取已知不含添加剂的空白样品，分别精密加入苏丹红对照品适量，按拟订的含量测定方法制备供试品溶液，测定每份样品屮苏丹红的含量，计算最低检出限。结果见表4表4最低检出限测定结果苏丹红i苏丹红ii苏丹红iii苏丹红iv按总蛋重计算（u g/kg）3.37. 17. 17.5按蛋黄重计算（u g/kg）9.420.420.421.55.实验结果在选定的条件下，苏丹红（i、ii、iii、iv）与样品中其他组分色谱峰可基线分离, 分离度均大于1

12、.5, k苏丹红i、苏丹红ii、苏丹红iii、苏丹红iv色谱峰z间基线分离, 分离度均大于15；按苏丹红（i、ii、iii、iv）峰计算，理论板数（n）均在10000 以上。对照品、供试品、加样回收试验、最低检岀限试验的hplc图谱见图14。6.讨论6.1层析用氧化铝活化程度的考察 不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，须 根据具体购置的氧化铝产品略作调整，活度的调整采用标准溶液过柱，将1 ug/ml的苏 丹红的混合标准溶液lml加到柱中，用5%丙酮正己烷溶液60ml完全洗脱，4种苏丹红 在层析柱上的流出顺序为苏丹红ii、苏丹红iv、苏丹红i、苏丹红iii,可根据每种苏丹 红的回收率作出判断。

13、苏丹红ii、苏丹红iv的冋收率较低表明氧化铝活性偏低，苏丹红 iii的冋收率偏低时表明活性偏高。为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时上样，在全程的层析过程屮不应使柱干涸，控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm。6.2溶解对照品溶剂的考察：文献中，对照品用乙瞇溶解后，用正己烷定容，其 中苏丹红i、苏丹红ii、苏丹红iv色谱峰峰形较好，但苏丹红iii色谱峰峰形较热 改用 丙酮定容后，苏丹红i、苏丹红ii、苏丹红iii、苏丹红iv色谱峰峰形均较好，理论板数 均达到10000以上，故确定对照品定容溶剂为丙酮。6.3提取方法的考察：采用欧洲标准方法，加样冋收试验中，杂质峰较多，对照

14、品色谱峰与样品中其他组分色谱峰不能基线分离，故未采用其方法；文献中，在洗脱 样品时采用10ml30ml止己烷淋洗氧化铝层析柱，直至流出液无色。弃去全部止己烷淋 洗液，用含5%丙酮的正己烷液60ml洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5ml, 经0.45 u m有机滤膜过滤后待测。但实际加样回收试验屮发现正己烷淋洗液屮含有绝大 部分对照品，而含5%丙酮的正己烷洗脱液中几乎无对照品，故将方法改为：在洗脱样 品吋用约40ml正己烷洗脱氧化铝层析柱，直至流出液无色，收集、蒸干后，用丙酮转 移并定容至2ml,经0.45 u m有机滤膜过滤后待测，加样冋收试验结果为冋收率在66% 80%之间，结果较好，采用改进方法。参 考 文 献1夏宁 苏丹红的种类及其对人类的危害 内肛科技2005年第四期 中华人民共和国国家标准gb/t1961-2005