海南石斛兰黑点病的病原鉴定【毕业论文绝对精品】

1、题 目: 学 号: 姓 名: 年 级: 学 院: 系 别: 专 业: 指导教师: 完成fi期:海南石斛兰黑点病的病原鉴定海南大学毕业论文（设计）b07120422007 级环境与植物保护学院农产品质量与安全系农产品质量与安全副教授2011年05月10日摘要木文研究的三亚地区石斛兰黑点病是一种真菌性病害。病斑多发生于 叶端及叶缘，发病初期在叶片上产生针尖大黑色小点。后期病斑逐渐扩展 成圆形大斑。病斑屮间深褐色，边缘黑色或暗黑色。发生在叶缘的病斑常 互相融合成不规则条形斑。严重时，叶片会局部坏死或整叶枯死。本试验 对石斛兰黑点病的病原菌进行分离纯化，再根据柯赫氏法则进行接种实验 发现该分离物能引致

2、与do间石斛兰病害和似的症状。提取病原菌菌丝dna 后应用rdna-lts序列分析鉴定，并随之进行同源性分析后发现菌株与 phyllosticta sp.的同源性为100%,表明石斛兰黑点病的病原菌为叶点寄 属phyllosticta ）。i大i此，本研究为该病害的科学防治提供了一定的指 导意义。关键词：石斛兰；黑点病；病原鉴定；叶点霉属abstractblack spot disease is one of the important plant disease of the dendrobium in sanya,hainan. the disease is belonging to a

3、fungal disease and occurs at the edge of leaf mainly. at first,the size of disease spot is very small and its color is black. later,the disease spot expands into a large,round spot gradually. the color of central disease spot is dark brown,while the edge's color is black or dark black. disease s

4、pot occuring at the edge of leaf formed into irregular stripe. when it was serious,some leaves died partly or integrally. during experiment,we got the pathogen coming from infected leaves through the process of separation and purification. and then,we cultivated pathogen on the pda. according to the

5、 koch's rule,we inoculated the separated pathogen to the tender leaves. after a period of time,we found that pathogen can cause the same kind of symptom on the leaves compared with the previous observeation in the field- through the pathogen dna cxtractionjdna-its sequence analysis and allogenic

6、 analysis,we found that the bacterial strain is similar to phyllosticta sp. completely. the above result demonstrated that the pathogen of black spot disease is phyllosticta . at the same time ,it provided certain theoretical basis for the disease control.keywords: dendrobium ； black spot disease； p

7、athogen identification； phyllosticta目录1前言42材料与方法52.1试验材料52.1.1试验样品52.1.2幽与试剂52.1.3培养基的配制52.1.4相关试剂的配制52.2主要仪器.62.3试验方法62.3.1病原菌的分离与纯化62.3.2病原菌的致病性测定7233病原菌的繁殖培养72.3.4病原菌dna的提取72.3.5 dna提取产物的检测72.3.6 dna提取产物的pcr82.3.7 pcr扩增产物的检测及冋收82.3.8 pcr回收产物的连接和转化92.3.9菌液pcr及阳性转化子测序103结果与分析103.1 d间病害症状103.2病害分离菌的

8、培养性状103.3分离物的致病性测定103.4病原菌rdna -its序列分析123.5提质粒电泳检测连接载体结果123.6 dna序列测定及同源性分析结果134结论与讨论13致谢15参考文献161刖吕兰花(cymbidium spp.)在植物学上属于单了叶兰科，为多年生草木植 物，附生、地生或腐生。兰花是有花植物屮最大的科之一，估计有800属, 35万个原生科»我国已知的兰屈植物有31利a占全球分展的一半以上。 分布地区很广，全国除华北、东北以外，都有分布。兰花不仅具有极高 的观赏价值，还具有独特的食用和药用价值。兰花的根、叶、花、果、种 了均有很高的药用价值。据资料报道，兰花对于

9、现代人类高发病症一癌症 也有较好的功效。海南地处热带亚热带，温暖潮湿，十分适合卡特兰、蝴蝶兰、石斛兰、 文心兰等热带兰花生长。近年来海南兰花产业发展十分迅速，种植面积从 20世纪90年代末的几千平方米发展到现在的25万m2以上然而，随着 海南兰屁产业快速发展，各种问题和继出现，制约兰花产业发展。尤其是 一些真菌、细菌性病害，以其病原多、传播快、潜伏期长等特征给兰花的 工产化生产带来不利影响，造成兰花观赏性降低，经济效益受损。兰花 主要的病害是由真菌引起的，至少占整个病害的2/3以上,主要有炭疽病、 黑点斑病、枯萎病、褐斑病、叶斑病和白绢病等。在三亚兰花种植基地 进行病害调查时，发现很多石斛兰叶

10、片上发生了一种较为严重普遍的黑点 病害。病斑多发生于叶端及叶缘，病斑屮间深褐色，边缘黑色或暗黑色。 严重时，叶片会局部坏死或整叶枯死。为了控制该病害在兰花上的继续发 生与为害，我们对引起海南石斛兰黑点病的病原物及其特性进行了研究。位于28s rdna的3端与18s rdna的5端之间的序列称为核糖体内 转录间隔区(internal transcribed spacers, its)。真菌的 rdna -its 序列是屮度重复序列，广泛分布于基因组。基于rdna-lts的多态性的序列 分析，由于可以从不太长的核酸序列小获得相对足够的信息用来反映生物 亲缘关系与分类情况，因而成为真菌分类及鉴定的依

11、据之一，目前己广泛应 用于真菌的属种间及部分种内组群水平的系统学研究。本研究采用了一 对真菌its扩增通用引物，通过对导致石斛兰黑点病的病原菌dna进行提 取扩增及序列测定再结合blast比对，确定了病原菌的类别，为此种病害 的科学防治提供了理论依据。2材料与方法2. 1供试材料2. 1. 1试验样品右斛兰病叶，采自于海南三亚柏盈兰花有限公司兰花种植基地。 2.1.2酶与试剂taq dna 聚合酶、t4 连接酶、loxtaq buffer、dntp mixture. pgmt 载体、dna marker ik 引物 its1： (5' -tccgatggtgaacctgcgg-3

12、9;)、 引物 its4: (5 -tcctccgcttattgatatgc-3?)、大肠杆菌 top1o 感受 态细胞、普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒。2. 1. 3培养基的配制按照方屮达切的方法配制pda培养基、pdb培养基及lb液休培养基。pda培养基：马铃薯200g,葡萄糖15g,琼脂20g,将洗净后去皮的马铃 薯切碎，加水煮沸0. 5h,然后用纱布过滤去掉马铃薯渣收集滤液，加水补 至1000ml,再将称量好的葡萄糖和琼脂加入，加热使琼脂完全融化后，分 装灭菌(121°c, 20min)<>pdb培养基：马铃薯200g,葡萄糖15g,将洗净后去皮的马铃薯切碎， 加

13、水煮沸0. 5h,然后用纱布过滤去掉马铃薯渣收集滤液，加水补至loooml, 再将称量好的葡萄糖加入，加热使葡萄糖完全融化后，分装灭菌(121°c, 20min)olb液体培养基：胰化蛋白月东10g,酵母提取物5g, nacllog,摇动容器 直至溶质完全溶解，用5mol/l naoh调ph至7. 0,并用去离子水定容至1l, 分装后高压灭菌(121°c, 20min)o2.1.4相关试剂的配制0. 5m edta：在 70mlddh20 溶解 1& 61gna2edta. 2h20,用 10m naoh (约 5ml)调 ph 至 8.0,补水至 100 ml0i

14、m tris. cl：在80mlddh20中溶解12. lg tris碱，用浓盐酸调ph至 8. 0,补水至 loomlo5mnacl：取29. 2g nacl加ddllo至100ml,放在全自动高温灭菌锅中,调节温度为121°c,灭菌20mino5m kac： 29. 5ml 冰乙酸用 koh 颗粒调 ph 至 4. 8, # ddh20 至 looml, 室温保存（不可高温灭菌）。3m naac： 50mlddh20 溶解 40. 81g naac. 3h20,用冰醋酸调 ph 至 5. 2, 加水定容至100ml,分装后高压灭菌，储存于4°c冰箱中。10%sds：称取

15、logsds溶于ddh20至looml,高压灭菌。20%pvp：称取20gpvp溶于ddh/）至looml,高压灭菌。氯仿/异戊醇（24/1）：量取氯仿、异戊醇体积比为24:1odntps的准备：将每种loomm的dntps各取10ul溶于360ul的ddh2o 中，即为2. 5mm的dntps。rnase 母液的配制：25mgrnase 酶溶于 loomm tris. hcl （ph 约为 7. 5）, 加15mm nacl配成lomg/ml, 100°c加热15min,冷却后分装于-20°c保存。loomg/ml amp:将lg amp溶于8ml水中定容至loml, 0

16、. 22m滤器超滤 除菌分装后贮t-20° c冰箱中备用。20mg/ml x-gal:将x-配1 （5-漠-4-氯-3-呵味一d半乳糖昔）溶于二 甲基甲酰胺屮配成20mg/ml的溶液贮于eppendorf管屮并包好锡箔贮于一 20°c冰箱屮备用。loomg/mliptg:将238mgiptg（异丙基|3d硫代毗喃半乳糖昔）溶于 10讥水中后用0. 22um滤器超滤除菌，分装成1讥小份贮丁一20°c冰箱中备 用。2. 2主要仪器恒温振荡器、pcr仪、恒温培养箱、洁净工作台、全自动高温灭菌锅、 琼脂糖凝胶电泳仪、紫外成像仪、台式离心机、数显恒温水浴锅、光学显 微镜、移

17、液枪、三角瓶、大小烧杯、玻棒、接种针。2. 3试验方法2. 3.1病原菌的分离与纯化挑取兰花病症比较明显的病叶，剪取病健交界处约5 mm见方的小块病 组织，经过70%乙醇和01%升汞消毒、灭菌水漂洗3次后，将小块病组织 转移至含pda培养基中。放在恒温培养箱中培养两天后，挑取菌落边缘的 菌丝进行纯化培养，保存备用。2. 3. 2病原菌的致病性测定按照方中达9】的方法，在a株石斛兰叶片上的一片幼叶用接种针刺3 组伤口，每组3个，作为接种处理组；在b幼株叶片同样刺3组伤口，每 组3个，作为对照组ck；从培养两天后的菌落边缘挑取适量菌丝接种到a 株幼叶的伤口处，带菌丝面向下，使其与伤口紧密接触，在该

18、叶片伤口处 接种3个重复。在b株幼叶上以喷无菌水作对照。保湿培养一段时间后， 观察叶片上的症状。2. 3. 3病原菌的繁殖培养在洁净工作台上，用接种针挑取菌落边缘的少量菌丝置于装有pda培 养基的三角瓶屮，再将三角瓶放在恒温振荡器屮，调节培养温度37°c,转 速160r/min,振荡培养三天，繁殖出大量菌丝为dna提取备用。2. 3. 4病原菌dna的提取参考谢人杰i等人介绍的方法进行dna提取，具体操作步骤如下。称菌丝组织lg,液氮研碎,加1.5ml（65°c预热的）细胞裂解液（即dna 提取液），再加150吐饱和酚、1.5nil氯仿，轻摇，65°c保温30mi

19、no取出后加 2ml5m kac（存 4°c）, -20 °c 放 30min, loooorpm 离心 lomin, 取上清，移至另一支7ml离心管。加0.6倍体枳冷异丙醇，0.1体枳3m naac,放于- 20°c冰箱2h。 loooorpm离心loinin弃上清，保留沉淀，70%冷乙醇洗涤两次，放洁净工作 台上吹干。力加lte（存4°c）, 10吐rnase摇匀放65°c水浴20min ,用等体积tris平衡酚抽提，氯仿/异戍醇抽提，室温放5min, loooorpm离心10min。取上清，等体积异丙醇、1/10v 3m naac, -2

20、0°c沉淀lh, loooorpm离 心10min,弃上清，70%冷乙醇洗涤，洁净工作台吹干后溶于100吐te, -20°c保存。2. 3.5 dna提取产物的检验取dna提取液4吐,澳酚蓝上样液4吐，将两者充分混合后放置于琼脂 糖凝胶电泳仪泳道内，电泳55min,将卡槽拿到紫外成像仪进行拍照，根据 dna带的亮度大小进行稀释，为pcr扩增进行准备。2. 3.6 dna提取产物的pcr依据dna带的亮度人小将dna提取液稀释20倍，取其稀释液进行pcr 扩增。pcr 反应体系为：loxtaq buffer 2. 5gl> dntp mixture 2吐、taq dna

21、 聚合酶0.4此、pcr扩增引物（its1、its4）各05此、dna模板2此，补 ddh20 至 25ptlopcr反应步骤为：94°c预变性5 min； 94°c变性30 sec, 51°c退火30sec, 72°c延伸45sec,循环33次；最后72°c延伸10 min。pcr扩增产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测2. 3. 7 pcr扩增产物的检测及回收2. 3. 7. 1 pcr扩增产物的检测取pcr扩增液25此、澳酚蓝上样液5吐，充分混合后用移液枪注入琼 脂糖凝胶电泳仪泳道内，在相邻的泳道内注入7m的marker ii,电泳50min,

22、 用紫外成像仪进行拍照显现dna带。根据带的亮度情况，在紫外线照射下 选择性地切下带有琼脂的dna条带。2. 3. 7. 2 pcr扩增产物的回收柱平衡：向吸附柱ca2中（吸附柱放入收集管）加入500平衡液bl, loooorpm离心lmin,倒掉收集管中的废液，将收集管中重新放回收集管中。将单一的dna条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干 净的离心管屮。向胶块屮加入3倍体积溶胶液pn （约为600吐），50°c水浴放置10min, 其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的 胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，宜至胶块完全溶解。将上一步所得溶

23、液加入一个吸附柱ca2中（吸附柱放入收集管中），室 温放置2min, loooorpm离心lmin,倒掉收集管屮的废液，将吸附柱ca2 放入收集管屮。向吸附柱ca2中加入600al漂洗液pw, loooorpm离心lmin,倒掉收集 管中的废液，将吸附柱ca2放入收集管中。向吸附柱中ca2加入600pl漂洗液pw, loooorpm离心lmin,倒掉废液。将吸附柱ca2放回收集管loooorpm离心加in,尽量除尽漂洗液。 将吸附柱ca2置于洁净工作台，室温放置数分钟，彻底晾干，以防止残留 的漂洗液影响下一步的操作。将吸附柱ca2放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 适量缓冲液eb

24、,室温放置2mino loooorpm离心2min收集dna溶液（为了 提高dna的回收量，可将离心得到的溶液重新加回到离心吸附柱屮，重复 步骤8）。2. 3. 8 pcr产物的连接和转化2. 3. 8. 1 pcr产物的连接利用回收试剂盒回收目的dna条带，将pcr扩增产物与pgm-t载体连 接，再转化至大肠杆菌top 10感受态细胞，在含有iptg和x-gal的lb平 板上筛选门色菌落。将pgm-t载体在冰上融化，短暂离心，以免液体挂在管辟上。按照一定的比例进行添加连接，载体与目的pcr片段的摩尔比控制适 当。连接体系:目的pcr片段4al、pgm-t载体1al、10xdna ligati

25、on bufferdna ligase （3um） 1pl、加 ddh20 至 10从。轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心，16°c水浴锅中连接过夜。 2. 3. 8. 2 pcr产物的转化转化平板的制备：向铺好的含有和应抗生素（loomg/ml）的固体琼脂 平板 lb 表面加入 4pl 的 ipig （200mg/ml）, 40pl 的 x-gal （20mg/ml）,使 用无菌的弯头玻棒将其均匀涂开，避光置于洁净工作台上，37°c放置lh, 使溶解x-gal的二甲基甲酰胺尽量挥发干净。取5从连接产物加到50m人肠杆菌top 10感受态细胞中（感受态细胞 从-70

26、76;c冰箱中取出，放于冰浴上，待刚刚解冻时加入连接产物，连接产物 的加入量不超过感受态细胞体积的1/10）,轻弹混匀，冰浴30mino将离心管置于42°c水浴90s,取出后立即置于冰浴屮23min,期间不 要振动离心管。向离心管中加入预热的（约37°c）、不含抗生素的lb培养基,180rpm,37°c摇荡培养45min,使质粒上和关的标记基因表达，菌体复苏。将离心管内容物混匀，吸取50ul已转化的感受态细胞加到含有相应抗 生素的lb固体培养基上，用无菌的弯头玻棒将细胞均匀涂开，将平板置于 室温育至液体被吸收，倒置培养，37°c培养1216h。pcr转化

27、产物的检测:将靠近蓝斑周围的单个白斑菌落用灭菌牙签接种 到5mllb液体培养基屮，37°c摇床摇荡培养1214h,保存菌种后提取质粒, 应用pcr扩增方法鉴定插入片段是否正确。2. 3.9液pcr扩增及阳性转化子测序取上述步骤8中菌液浑浊的液体进行pcr扩增。pcr扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因是否与载体连接。将阳性转化了送广州华大基 因科技股份有限公司测序。pcr 反应体系:菌液 0. 3 gl,引物 itsl(10um)0. 5吐，引物 its4(10um)0. 5吐，10xtap buffer 2. 5pl, dntp mixture 2al, taq dna 聚合酶

28、(2. 5u/al)0.4al,加入ddh20定容至25m。pcr反应步骤为：94°c预变性5 min； 94°c变性30 sec, 51°c退火30sec,72°c延伸45sec,循环33次；最后72°c延伸10 min。3结果与分析3.1田间病害症状石斛兰黑点病主要危害叶片，多发生于叶端及叶缘。初期在叶片产生 针尖大黑色小点。后期病斑迅速扩人为圆形人斑。病斑中间深褐色，边缘 黑色或暗黑色。发生在叶缘的病斑常和互融合成不规则条形班。严重时， 叶片会局部坏死或整叶枯死（如图1-a）o3. 2病害分离菌的培养性状在pda上，病原菌的分离物经过一段

29、时间的纯化培养形成菌落。菌落 呈圆形，生长快速，大而致密。表面颜色为灰褐色，不透明，正反两面颜 色较接近。菌落比较干燥，边缘整齐。挑取该培养基上的菌丝制片观察， 其形状为丝絮状，中间有横隔（如图1-b）o3. 3分离物的致病性测定回接病原物至健康石斛兰植株的幼叶上,通过伤口接利u如图2-a）,发现在温度20°c25°c、湿度大于90%时，经过15d左右病原菌可侵入叶片内引 起与出间石斛兰病害相同的症状（如图2-b） o而对照组采用喷洒无菌水处 理，在相同吋间过后，叶片针刺部位无明显变化，只是针刺部位稍微凹陷。 从患病部位重新分离病原菌，纯化培养后得到和同形态的菌落，表明从石

30、 斛兰患病部位分离到的病原菌为出间石斛兰病害的致病菌。图1病叶症状及病原菌菌落形态a石斛兰病害r1间症状b分离物的菌落形态图2病原菌冋接及发病症状a健康叶片针刺伤口后，挑取菌丝块接种b成功接种发病的兰花叶片3. 4病原菌rdna -its序列分析从琼脂糖凝胶电泳检测结果表明（如图3）,用引物its1和its4扩增得 到的兰花黑点病菌株的rdna-lts区域序列，菌株的pcr产物条带在一条直线匕线条清晰明亮，长度约为600 bpom 12bp1200700.504300-100-34600bp1-4：病原菌dna提取液its扩增结果m： dna marker ii图3 pcr产物的检测电泳图谱3

31、.5提质粒电泳检测连接载体结果从琼脂糖凝胶电泳检测结果表示（如图4）,采用的引物能扩增得到预期大小的产物，电泳呈单一明亮条带，表明目的基因片段与pgm-t载体成功连接。bp1200-700500300一1001-4：挑収口斑鬧洛培乔旳菌液 m： dna marker 11 图4提质粒进行pcr检测目的片段连接至载体的电泳图谱m 12343.6 dna序列测定及同源性分析结果tactcactatgttgctttggcgggtcgacctggttccgacccaggcggccggcgcccccagccttaactggcc aggacgcccggctaagtgcccgccagtatacaaaactc

32、aagaattcattttgtgaagtcctgatatatcattt aattgattaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagt aatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccctctggtattccggagggc atgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcaagctctgcttggtattgggcaacgtccgctgccggacgtgcct tgaagacctcggcgacggcgtcctagcctcgagcgtagtagt

33、aaaatatctcgctttggagtgctgggcgacg gccgccggacaatcgaccttcggtctatttttccaaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaact taagcatatcaataagcggaggaaatcactagtgaattcgcggccgcctgcaggtcgaccatatgggagagct cccaacgcgttggatgcatagcttgagtattctatagtgtcacctaaatagcttggcgtaatcatggtcatag ctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaaca

34、tacgagccg通过对病原菌rdna-its序列在genbank数据库中进彳亍megablast同源性 分析，结果表明菌株与phyllosticta sp.的同源性为100%,根据该比对结 果以及病原菌回接在石斛兰叶片上的致病症状，将石斛兰黑点病的病原物 鉴定为叶点霉属，为半知菌类真菌。4结论与讨论叶点霉属phyllosticta )是person于1818年创立的展名。因在国 际半知菌类命名法规有效期(1828)之前，故将其属名作为无效属名处 理。1847年desmazieres重新描述了该属为有效属名phyllosticta per. ex desm. o其模式种为铃兰叶点霉(q con

35、vallariae pers.),目前全世界已 报道phyllosticta 2000余种说叶点霉属形态与茎点霉属相似，寄生 性较强，主要危害叶片引起叶斑病。通过上述实验中对石斛兰病害病原物的菌落形态观察，病原菌的致病 性测定以及通过提取病原菌dna后的rdna-its序列测序和同源性分析，初 步确定引起海南石斛兰叶片黑点病的病原为半知菌类腔抱纲球壳抱目叶点 霉属(phyllosticta sp.)。据资料报道，引起海南热带兰花发生黑点病 的病原物为半知菌类亚门真菌，多为叶点霉屈，有的为大茎点霉、壳针砲 霉和壳二泡霉。但目前，国内尚未出现对石斛兰黑点病的病原物进行鉴定 的资料。因此，本研究为病

36、害的科学防治提供了一定的理论依据。在实验过程小，病原菌分离物在一定时间内未能产生分生孑包子，导致 不能依据分生抱子器形态、分生砲子形状大小这些特征从传统的真菌形态 观测角度去鉴定病原物，因而对病害病原的准确鉴定产生了不利影响。此 外，由于皿间病害的发生需要具备高温高湿的环境条件，而进行实验时气 温相对较低且不稳定，因而在做病害分离物的致病性测定时，分离物在叶 片上从接种到发病经历的时间较长，可能是与上述环境因素存在一定的联 系。在进行blast比对分析吋，核酸序列数据库中较多的相似序列会给比对 分析工作带來两方面的影响：一是能提供更大的参考意义和更丰富信息用 于系统学研究，另一方面过多的相似序

37、列也会给鉴定工作带来一定的困难 2，而且随着genbank的不断丰富，相似序列述会更多，此时：最好再 使用其它序列比对分析工具也许会有益于鉴定工作，如使用dnaman所绘制 的系统树(phylogenetic tree)可能会发现与待检序列的同源性距离最近的 序列。结合形态学、生化等表型方法进行鉴定，不能过分依赖its序列 分析而把它作为传统真菌形态学方法的替代方法。口前rdna-its序列分析并不是能对所有真菌的属种或组群进行鉴别， 究其原因：其一，its区序列尽管是可变的，但对于某些物种其可变的程度 相对不高，并不足以用来分析其属种或组群间的差异2叫 其二，its序 列分析结果还受到比对使用的基因库完善程度的影响。因此,在基因库中存 在的、与待检真菌亲缘关系相近的已知真菌序列缺乏时或rdna-its序列上 表现为极小的差异性时，its序列分析的应用能力就受到一定的限制,此时, 建议将its序列分析结果与传统的真菌形态学鉴定结果(真菌培养特征、镜 检特征等)相结合才能正确地对真菌进行鉴定，以防止误检、错检。尽管目 前rdna-its序列分析的应用存在一定的限制，但随着新技术新方法在its 序列分析上的运用以及生物信息学的不断完善，相信rdna-its序列分析的 应用将会有更大的发展空间。致谢木文是在史学群老师的悉心指导下完成的。史老师从选题、撰写