托布津降解菌的分离筛选及鉴定

1、毕业论文题目：托布津降解菌的分离筛选及鉴定学院:牛命科学学院专业：生物科学毕业年限：2013 年学生姓名：李亮亮学号:200974010121指导教师：张爱梅托布津降解菌的分离筛选及鉴定李亮亮指导老师：张爱梅(西北师范大学 生命科学学院，甘肃 兰州730070)摘 要：于2013年9月采集兰州交通大学后山的一处样地土壤，此土壤为长期施用过甲基托 布津的蔬菜种植大棚土壤，从中分离纯化岀能够降解甲基托布津的菌株1株，并对其进行形 态观察及牛理生化鉴定后，初步确定该菌株屈于葡萄球菌屈hafnia sp.)。关键词：细菌；托布津降解菌；分离；鉴定the separation and identific

2、ation of bacteria for degradingthiophanateli liangliang(college of life science, northwest normal university, lanzhou 730070)abstract: the soil was collected in september 2013 which were used thiophanate long-term the plots were cultivated vegetable and located on the hill behind lanzhou jiaotong un

3、iversity. the one strain was isolated from the soil sample. the strain can degrade thiophanate. the morphological was observed and the physiological and biochemical test were carried out. the strain belongs to hafnia sp.keywords: bacteria; degrading thiophanate bacteria; separation; identification人类

4、从20世纪40年代起开始使用农药除虫除草，每年挽冋农业总产量15% 左右的损失。但是，长期大量农药的使用，使环境屮的有害物质大大增加，危害 到生态和人类健康。据报道，农药利用率一般为10%,约90%残留在环境屮，造 成对环境的污染。甲基托布津(topsinm)是一种广谱性内吸低毒杀菌剂，通用名称是甲基硫菌 灵(thiophanate-methyl),化学名称是1,2二(3甲氧碳基2硫jr基)苯，cas号为 23564-05-8,结构式如图1所示。甲基硫菌灵属于苯并咪卩坐类，纯品为无色结晶， 原粉(含量约93%)为微黄色结晶。比重1.5( 20 °c),熔点172°c,蒸汽压

5、949.1xlo8pa(25°c),儿乎不溶于水，可溶于丙酮、甲醇、乙醇、氯仿等有机溶剂，对酸、 碱稳定山。ohco时-och3s o图1卩基托布津的分子结构式figi mildolhanc molecular structural formula甲基托布津(topsin-m)最初是由日木曹达株式会社研制开发出来的。能够有效 防治多种作物的病害，如用于小麦、水稻、甘薯、瓜类、番茄、桑树、苹果树、 禾谷类、油菜、菜花、甜菜、蔬菜、马铃薯、葡萄、烟草、柑桔树、毛竹、花生、 兰花等防治多种病害，其内吸性比多菌灵强。甲基托布津按英化学结构属取代苯 类杀菌剂，被植物吸收后即转化为多菌灵，它主要

6、干扰病菌菌丝形成，影响病菌 细胞分裂，使细胞壁中毒，砲子萌发长出的芽管畸形，从而杀死病菌，残效期5 至7天。主要用于叶面喷雾，也可用于土壤处理。虽然甲基托布津是一种低毒杀 菌剂，它既能防治农林病虫害，也会对人畜产生危害，形成农药污染，并且已经 发现了多起屮毒事件。关于植物源性食品屮甲基托布津残留量的检测方法，1=1前 有气相色谱法，紫外分光光度法，气相色谱法，采用木方法对某菜市场交易的植 物源性食品样品进行检测，总计检测了 38批植物源性样品，包括玉米、黄瓜、青 椒、西兰花等品种,结果有2批样品检测出甲基托布津的残留量分别为11.0 mg/kg. 9.2mg/kgo并且，经呼吸道及皮肤吸收甲基

7、托布津而致急性中毒的事件也早有发 生，咪吐类农药慢性中毒时，引起倦乏、头疼、食欲不振、肝脏损害等叫甲基托布津还能使铜离子在土壤上的表观吸附量増加。甲基托布津与某些金 属离子可以形成不溶性络合物，导致一些金属离子的缺乏，影响植物的生长，随 着分子生物学的飞速发展，随着研究的不断深入，利用微生物降解农药等环境污 染物，保护环境不久将会变成现实。人类从20世纪40年代起开始使用农药除虫 除草，每年挽凹农业总产量15%左右的损失。但是，长期大量农药的使用，使环 境屮的有害物质大大增加，危害到生态和人类，形成农药污染。据报道，农药利 用率一般为10%,约90%残留在坏境中，造成对环境的污染叫 我国是农业

8、大国， 化学农药的使用量全球第一，据统计，我国每年农药使用面积达1.8亿公顷次， 上世纪50年代以來使用的666达到400万吨、ddt50多万吨，受污染的农田1330 万公顷。因此，寻求有效的农药降解方法是目前面临的严峻问题，而微生物作为 一种能降解农药等人分子物质的生物，其研究亦受到越来越多的关注。当有毒农 药施用在农作物、蔬菜和果树上时，残留在作物表而上的农药，由于脂溶性强， 很容易渗入作物表皮的蜡质层，以致很难完全淸洗掉。如果以这些受污染的粮食、 蔬菜做牲畜的饲料，则残留的农药就会转移到肉类、乳类和蛋品屮引起污染，m 终随食物进入人体。农药还会随农田的灌溉水排入江河，以致农药存留于耐药性

9、 强的水生植物中，随后经过复杂的生物化学循环而在鸟类、鱼类和水禽体中积累 起來，随着食物链的营养层次逐渐富集和转移，最终进入人休，引起慢性中毒， 甚至导致癌症。农药主要是通过食物链进入人体，在脂肪和肝脏中累积，从而影 响止常的生理活动。影响农药降解的因素较多，主要表现在农药分子结构的影响， 农药的浓度，环境条件的影响，ph值对菌株降解率的影响，一般情况下，菌株的 降解率在ph为6-8 z间较高，这种情况与菌株的生长较好有关，温度对菌株生长 的影响，一般情况下，菌株在20 °c以下生长较差，降解率较低，25-40°cz间生 长较好，降解率较高，45°c以上由于生长受

10、到限制导致降解率低，忖前进行的 农药微生物降解研究多停留在实验宗水平与人皿的农药应用情况相比较，是 在相当强的选择压下分离降解菌，h常用纯培养方法进行试验，得到的降解菌应 用到皿间或自然环境条件下其降解活性容易丧失。另外，在实验室里得到的微生 物在向大皿释放和直接应用时对环境的安全性以及对人和其它生物是否有害必须 认真深入细致地研究。应该指出，如果过分强调或夸人基因工程菌的危害，将会 使人们失去一种降解环境污染物的强有力工具。如何使实验室得到的结果与大 出应用相结合，是一个有待进一步探讨的复杂而具有实际意义的课题。随着分子 生物学的飞速发展，随着研究的不断深入，利用微生物降解农药等环境污染物、

11、 保护环境不久将会变成现实。本文拟对托布津降解菌的优势种分离并对其进行初 步鉴定。1材料与方法1.1实验材料1丄1采样地的自然概况土壤样品采口兰州市安宁区交通大学后山附近的一个农家院。安宁区位于兰 州市黄河北岸,为兰州市西北郊区,地处东经103°34r 103°47北纬36°5z 36。10。安宁区海拔1517.3米至2067.2米，相对高差550米。1.1.2采样用具装样纸袋（记录采样地、h期、采样深度、部位、土壤名称、采样人、编号 等）、采样勺、取土铲、银子、剪刀、铅笔、记号笔、圆珠笔、掘根器、地温计、 手套、灭菌袋、标签纸、皮筋等。1.1.3样品的采集于20

12、12年9月采集于兰州交通大学后山的一块样地，此样地为长期施用托布 津的蔬菜大棚。采用五点収样法取样，先确定该温棚对角线的中点，再在对角线 上选择四个与屮心样点距离相等的点作为样点，然后用土铲分别将选好的五个样 点掘取15cm左右，用地温计测量土壤温度。将土壤装入灭过菌的灭菌袋屮，摇 匀，扎好，标记（记录釆样时间、地点、环境条件等）。为了使土样中微生物的数 量和类型尽量少变化，将样品采回后立即处理并进行实验。1.2实验仪器及药品1.2.1实验仪器电子分析天平，超净工作台，恒温培养箱，架盘药物天平，高圧蒸汽灭菌锅, 三角烧瓶，试管，显微镜，载玻片等。1.2.2实验药品75%甲基托布津可湿性粉剂。1

13、.3培养基1.3.1富集培养基配方：k2hpo45.71g； kh2po41.70g； （nh4）2so42.63g； mgso4-7h2o 0.095g； mns040.05g； feso4 0.05g； cacl2 0.003g；蒸憾水 1000ml；甲基托布津 10ml用途：使混合微生物中的甲基托布津降解菌的数量比例不断增高，并引向纯 培养。1.3.2分离纯化培养基组成：同富集培养基，其屮加入琼脂10g。用途：纯化菌种，分离出托布津降解菌，用于生理生化鉴定。1.3.3 lb培养基组成：酵母菌提取物5g；蛋口腺10g； nacl 10g；蒸镭水1000ml；琼脂10g。用途：保存纯化的菌株

14、。134葡萄糖蛋门腺水培养液组成:葡萄糖0.5g；蛋白月东0.5g； k2hpo40.2g；蒸憾水100ml； ph7.27.4。用途：用于菌株的鉴定（伏普试验，甲基红试验）。135葡萄糖水培养液组成:蛋白月东2.7g； nac15.0g；葡萄糖10g； 0.2%溟麝香酚兰0.03g；蒸馆水1000ml； ph 7.0o用途：用于葡萄糖发酵试验。1.3.6蛋白月东水培养基组成:蛋白月东lg; nacl 0.5g；蒸憾水100ml； ph7.8o用途：用于口引喙试验。1.3.7醋酸铅培养基组成:蛋白月东10g；牛肉浸粉3g； nacl 5.0g；硫代硫酸钠2.5g；琼脂12g； 蒸憾水 100m

15、l； ph7.3o用途：用于h?s试验。138淀粉培养基组成:蛋白月东10g； nacl 5.0g；牛肉膏5g；可溶性淀粉10g；琼脂15g；蒸憾 水 1000ml o用途：用于淀粉水解试验。1.4实验方法141托布津降解菌株的分离和纯化 1.4.1.1培养基的制备何(1) 富集培养基的制备根据培养基的配方，配置足量的培养基，将培养基分装在三角瓶中，用棉塞 塞紧，121 °c下灭菌30min,灭菌结束后的培养基置超净台上，待冷却至50°c时， 备用。(2) 纯化培养基的制备根据培养基配方，配置足量纯化培养基，在121°c下灭菌30min,取出后，待 培养基冷却至5

16、0°c时倒平板，平板倒好后，待冷却凝固后备用。(3) lb培养基的制备根据培养基配方，配置足量纯化培养基，在121°c下灭菌30min,将灭过菌的 试管摆成斜面，冷却，待用。1.4.1.2分离和纯化步骤称取土样10g，加到90ml含托布津浓度为200mg/l的富集培养液中，28£摇 床培养三天，然后吸取5ml培养液转接至托布津浓度为400mg/l的富集培养液中， 相同条件下培养三天，稀释使托布津浓度依次为200、400、600、800、1000mg/lo 富集完毕后，用移液枪吸取200ul培养液均匀涂布于相同浓度的托布津分离纯化 培养基平板上，28°c培

17、养箱屮培养，待平板上出现单菌落后，挑取周围有透明圈 的菌落转接至lb培养基上，28°c培养纯化，保存3。1.5托布津降解菌的鉴定参考一般细菌常用鉴定方法对菌株进行形态学观察和生理生化实验。151形态观察对分离纯化的菌株进行菌体形态、菌落特征等的观察，菌落特征主要包括生 长速度，菌落颜色，菌落高度，菌落表面，菌落质地，菌落边缘等。1.5.2生理生化鉴定(1) 革兰氏染色通过革兰氏染色法鉴定待试菌株。阳性用“+j阴性用“表示。(2) n引味试验有些细菌可以分解色氨酸生成眄i味可以与二甲基氨基苯甲醛反应生成红色的 玫瑰眄i味，因此可根据细菌能否分解色氨酸产生卩引味来鉴定菌种。挑取已经纯化

18、的菌株于蛋白月东水培养基屮，培养2d后，向培养液屮加入34滴乙瞇，摇动数次, 静置1 -3min,待乙瞇上升后，然后沿试管壁徐徐加入2滴“引味试剂，此时，切勿 摇动试管，观察结果，观察在乙瞇和培养物z间是否有红色环状物出现。如果有, 则为阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“+”、阴性用表示。（3）甲基红试验某些细菌在糖代谢过程屮，分解葡萄糖产生丙酮酸，内酮酸可进一步分解， 产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的ph降至4.5以下，当加入甲基红试剂则呈 红色，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化 为其他物质（如醇、酮、瞇、气体和水等），则培养基的酸度仍在ph6.2以上， 故

19、加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。将待检菌接种于蛋门月东水培养基中，培 养24d,向一支蛋白豚水培养基屮加入甲基红试剂2滴，立即观察结果。若呈 现红色，则为阳性；若呈现橘红色，则为弱阳性；若呈现黄色则为阴性。主要用 于鉴别人肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。此外肠杆菌科中沙 门菌属、志贺菌属、枸椽酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼 亚菌属则为阴性。阳性用“+"、阴性用表示。（4）伏普试验伏普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生菲酸性或屮性末端产物的能 力，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱竣生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件 卜能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙

20、酰与蛋门月东中精氨酸的呱基作用，生成 红色化合物，即伏普阳性反应，不产生红色则为阴性。挑取已经纯化的菌株于蛋 白月东水培养基中，培养2d后，向一支蛋白腺水培养基中加入510滴40%koh, 然后加入等量的5%的a蔡酚溶液，再放入37°c温箱中，保温15-30min,观察结 果。阳性用“+'，、阴性用表示。（5）托布津浓度实验选择适宜的ph,培养温度和接种量，使培养液屮托布津浓度分别为200mg/l, 400 mg/l, 600 mg/l, 800 mg/l, 1000 mg/lo如图2所示，用已用打孔器打好的 纸片分别蘸取以上浓度的培养液，然后贴在已培养菌株的平板上，并且将蘸

21、有不 同浓度甲基托布津的滤纸片贴在同一个培养基上，对比观察不同浓度下水解圈的 大小性（6）h2s试验实验使用sim培养基，内含蛋口质与硫代硫酸钠作为硫质，另含硫酸钱亚铁 （ferrous ammonium sulfate； fe（nh4）2so4）作为硫化氢指示剂，（硫化氢为无色气 体，不易察觉，硫酸较亚铁之亚铁离子可与硫化氢反应生成不溶性硫化亚铁之黑 色沉淀。）培养基含0.3%琼脂使成半固体，以增强厌氧呼吸，亦可观察微生物之 运动性，如具运动性，则微生物生长沿接种线向四周扩散，使培养基呈混浊，如 无运动力，则生氏仅限于接种线。用接种针将菌株穿刺接入醋酸铅培养基，置37°c, 培养4

22、8ho观察结果，若产生黑色沉淀，则为阳性反应，否则为阴性反应。阳性 用“+”、阴性用“表示。（7）淀粉水解试验淀粉水解试验是淀粉这种多糖水解成单糖的试验。微生物对大分了的淀粉不 能直接利用，必须靠产生的胞外酶将人分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞 外酶主要为水解酶，通过水解晦的作用将分子量大的物质降解为较小的化合物， 使其能被运输至细胞内。首先准备淀粉培养基平板，将熔化后冷却至50°c左右的 淀粉培养基倒入无菌平皿中，待凝固后制成平板。其次，接种，用记号笔在平板 底部划成两部分，在每部分分别写上菌名，用接种环取少量的待测菌，点接在培 养基表面的相对应部分的中心，其中一个菌种应是枯草

23、杆菌做对照菌；下一步培 养，将接种后的平皿置于37°c恒温箱培养24h；最后检测，取出平板，打开平皿 盖，滴加少量的碘液丁平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。菌落周i韦i 如出现无色透明圈，则说明淀粉已经被水解，表示该细菌具有分解淀粉的能力。 可以用透明圈大小说明测试菌株水解淀粉能力的强弱。阳性用“+"、阴性用7表示。（8）葡萄糖发酵试验在细菌鉴定中，糖类发酵产酸是1项重要依据。细菌对糖类的利用有2种类 型：1种是从糖类发酵产酸，不需要以分了氧作为最终受氢体，称发酵型产酸； 另一种则以分了氧作为最终受氢体，称氧化型产酸。首先接种，以18-24h的幼 龄菌种，穿刺接种在

24、上述培养基屮，每株菌接4管，其屮2管用油封盖（凡士林: 液体石蜡=1：1混合后灭菌），约加0.5 1厘米厚，以隔绝空气为闭管。另2管不封油为开管，同时还要有不接种的闭管作对照。适温培养1、2、4、7天观察结 果。结果观察，氧化型产酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部产碱(l-2d),后 来才稍变酸。发酵型产酸则开管及闭管均产酸，如产气，则在琼脂柱内产生气泡。 先制备好葡萄糖发酵培养基，然后挑取适量的菌株接种到培养基屮，在37°c恒温 箱培养24h,然后观察培养基颜色的变化。2结果与分析菌株的菌落形态特征菌落形态图菌株菌落形态特征：圆形，边缘整齐，在牛肉膏蛋白腺固体培养基上呈乳黄 色，表面

25、光滑，湿润，隆起，菌体透明。表1菌株形态特征table 1 the morphological features of bacterial菌落特征 生长速度：速度一般，培养一周后，菌落直径l-2cnio 菌落颜色：菌落较乃，呈淡黄色，培养一段时间后， 颜色加深。 菌落表面：光滑有光泽，湿润，粘稠，易挑起，圆形 凸起，不透明，培养一周后，较干燥。 菌落质地：质地均匀，正反面，边缘，中央部位的颜 色都很均一。 菌落边缘：整齐。 菌落禹度：0.20.5cm。 培养基颜色基本不变，培养十一天后，有的菌落边缘 出现红色。2.2托布津浓度对菌株生长的影响配制不同浓度的托布津溶液，检测其对菌株生长的彩响。实

26、验结果见表1, 可见，当甲基托布津浓度为800mg/l时，水解圈最大。衣2不同托布津浓度下水解圈的大小table2 hydrolysis under different concentrations of thiophanate ring size甲基托布津浓度(mg/l)水解圈的直径(mm)2004040060600808001001()(x)80菌株在加有甲基托布津的平板上的牛长情况见图2。图2甲基托布津对菌株生长的影响fig2 the influe nee of mildothane for strain2.3生理生化实验结果表3生理生化鉴定结果table 2 the results o

27、f physiological and biochemical identification生理生化实验鉴定结果革兰氏染色+硫化氢试验-葡萄糖发酵试验+伏普试验-口引味试验甲呈红试验-运动性直线运动需氧性需氧3结论与讨论木文采取富集培养技术从土壤中分离出能降解甲基托布津的菌株，在富集培 养后纯化时得到了能降解甲基托布津的菌株，挑取生长旺盛的菌株进行纯培养， 通过对该菌株生长形态观察和生理生化试验，查阅相关书籍将该菌株初步鉴定为 葡萄球菌属(hafriia sp)。实验通过对比不同农药浓度下水解圈的大小来确定菌株生长所需的最适农药 浓度，由实验数据可知，当托布津浓度小于800mg/l时，随着浓度

28、的增大，水解 圈也随着增人，即托布津浓度与水解圈直径成正比，当托布津浓度人t* 800mg/l 时，水解圈乂变小，即托布津浓度与水解圈直径成反比，当托布津浓度为800mg/l 时，水解圈最大，即该菌株生长的最适托布津浓度为800mg/lo菌株生长十一天后, 培养基出现红色，有可能是由于菌株生长较长时间后产生的色索，也有可能是培 养基成分发生变化所致，此问题述有待下一步研究。该实验所获得的菌株是在28°c 条件下分离纯化出来的，通过生理生化鉴定结果可知，此菌株可分解葡萄糖并产 生酸，也可分解色氨酸，但不能分解淀粉，也不产生h2s。通过对甲基托布津降 解菌的研究，对利用微生物降解农药等环

29、境污染物、保护环境有更进一步的认识。高效剧毒的农药，毒性大，且在环境中残留的时间长，当人畜食用了含有残 留农药的食物时，就会造成积累性中毒。这类危害往往要经过较长时间的积累才 显示出症状，它又是通过食物链的富集作用，最后才进入人体，不易及时发现， 因此，一般不为人们所重视，而且这类污染范围广，危害的人数多，在许多情况 下，是人类自己在毒害自己，所以说，这类危害更加危险。环境中的温度、ph、水分含量、有机质含量和含氧量等变化会直接彩响到微 生物对农药的降解。一般来说在高温湿润、有机质含量丰富、ph偏碱性的情况下, 农药容易被降解，如何克服环境的影响从而充分发挥微生物对农药的降解是需 要解决的一个

30、关键问题。口前进行的农药微生物降解研究多停留在实验室水平a 61,与大d的农药应用情况相比较，是在相当强的选择压下分离降解菌，且常用纯 培养方法进行试验，得到的降解菌应用到口间或口然环境条件下其降解活性容易 丧失。另外，在实验室里得到的微生物在向人田释放和直接应用时对环境的安全 性以及对人和其它生物是否有害必须认真深入细致地研究。应该指出，如果过分 强调或夸大基因工程菌的危害，将会使人们失去一种降解环境污染物的强有力丁 具。如何使实验室得到的结果与大出应用相结合，是一个有待进一步探讨的复 朵而具有实际意义的课题。随着分了生物学的飞速发展，随着研究的不断深入，利用微生物降解农药等环境污染物以及保护环境将会变成现实。参考文献：1 刘乾开，朱国念等.新编农药使用手册m.上海：科学技术出版社，1999.519524.2 叶必智，谢声严,王松媛.一起急性甲基托布津农药中毒调查报告j.环境科学,1996, 34(5)： 521524.仪美芹，王开运，姜兴卬等.微生物降解农药的研究进展j.山东农业人学学报(自然科学版)，2002, 33( 4)： 519524.4 彭国丽.甲基托布津对土壤小铜离子吸附影响及机理探讨j.环境污