生物工程专业毕业论文

1、脂质体介导的cho细胞转染脂质体介导的基因真核细胞转染专业：生物工程专业班级：2008级二班姓名：周密摘要cho细胞是中国仓鼠卵巢细胞，是目前生物工程上广泛使用的细 胞系。真核细胞中cho细胞是冃前重组糖基蛋白生产的首选体系。外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体 介导法和病毒介导法。脂质体是磷脂分散在水中吋形成的脂质双分子层，又称为人 工生物膜。根据膜的融合及内吞作用，可用作外源物质进入细胞 的载体。在对生物大分子的传递过程中，脂质体是十分有效的载体，无论 对微生物还是对植物细胞或对哺乳动物细胞导入外源dna,脂质体的 包裹都能对抗核酸酶的消化。脂质体的制备主要有超声波法、

2、磷脂酰丝氨酸02+离子融合法和 逆相蒸发等，用超声波法可制备的单层或多层脂质小体能向细胞内引 入的物质量少，故常用后两种方法制备大的脂质体。脂质体介导转染 法的改进方法包括促进转染的脂类、增加转染效率的添加剂、dna与 脂质体最佳比率的确定。本实验将携带绵羊p基因的绿色荧光蛋白真核表达载体转入中国 仓鼠卵巢细胞，得到稳定表达绵羊prp基因的cho细胞系。得出外源 导入cii0的绵羊prp可以在cii0中稳定表达的结论。关键词：cho细胞、脂质体、转染abstractcho cells of chinese hamster ovary cells, biological engineering

3、is currently widely used cell lines. eukaryotic cel 1s in cho cells is currently restructuring glycosyl protein of choice for the production system.exogenous genes into cells mainly has four kinds of met hods: electric shock method, calcium phosphate and mediated by liposome and virus mediated metho

4、d.liposome is a phosphol ipid dispersed in water is formed when the 1 ipid bi layer, also known as the artificial biological membranc. according to the membrane fusion and endocytosis，can be used as exogenous substances into the cell carrier.on biological macromolecules in the transfer process, 1ipo

5、somes are very effective carrier, regardless of the microorganism or plant cell or mammalian cells for introducing exogenous dna, liposome encapsulated can against nuclease digestion.preparation of liposomes are ultrasonic method, phosphatidylserine ca2+ ion fusion method and reverse phase evaporati

6、on, using ultrasonic method to prepare monolayer or multi layer 1 ipid globules to int racel lular introduced mass is less, so commonly used two met hods for prepara tion of large liposomes. liposome mediated transfection method improvement methods include promoting transfection lipids, increase in

7、transfection efficiency additives, dna and liposome best rate determine.this experiment wi11 carry sheep p gene green fluorescent protein eukaryotic expression vcctor was transfected into chinese hamster ovary cells, stable expression of prp gene in sheep in the cho cell line- draw foreign import ch

8、o sheep prp can cho stable expression of the conclusion.key words: cho cells, 1iposomes, transfection引言lipofectamine 2000转染试剂是一种阳离子脂质体，在体外可 以转染许多种哺乳动物细胞，对各类细胞系都可提供最高的转染效 率，具有高效性和操作步骤简单的优点。其转染效率以及细胞活性取 决于许多实验因素,如细胞密度、脂质体和dna的浓度、脂质体2dm 复合物的作用吋间以及是否有其它介质成分如抗生素和血清。使用lipofectamine 2000试剂，可以获得：在多种细胞系中具 有极

9、高地转染效率和较高水平地重组蛋白表达；传输sirna的优异性 能；在有血清存在的情况下可保证转染效力转染后无需更换培养 基；保证可以用于高通量应用的试剂；用于建立稳定细胞系的可靠试 剂lipofectamine 2000试剂为大多数细胞提供了最高的转染效率和 活性。当存在血清或用于进行蛋白表达的细胞系（如cos-7, cho和 293）时,lipofectamine 2000尤为有效,效率可超过90%。本实验将构建了 cii0细胞培养基及cii0细胞的培养，并利用脂质 体转染试剂转染cho细胞中，观察全长的重组绵羊egfp-prp是否表 达，能否得到稳定表达绵羊prp基因的cho细胞系。1实验

10、综述1.1细胞转基因的研究进展数百万年来原核生物如大肠杆菌经常相互分享它们的遗传物质， 人们受到自然的启发出现了将dna导入培养细胞的技术。随着这种技 术的不断进步，人们可以在培养细胞中进步各种外源基因的表达，主 产制备大量经过真核细胞翻译后加t的特有的活性蛋白，研究基质的 功能，表达蛋白的结构、生化特性和基因表达的调控机理等。1.2细胞的转染方法转染就是让外源核酸进入真核细胞中，已经成为研究和控制真核 细胞基因表达的重要阶段。如今广义的转染不单包括了 dna、rna, 还有蛋白质等生物大分子。核酸转染技术在21世纪60年代末和70 年代初期已经建立，最早使用的方法是磷酸钙法和用deae de

11、xtran 乙胺乙基葡聚糖）作为载体使dna吸附于细胞表面的方法。至今己经 有多种方法可以用于转染。常用的转染方法有:磷酸钙法、deae 一葡聚糖法、电穿孔法（电 击基因导人法）、脂质体转染法，另外还有细胞核的直接微注射法、 pol沙rene介导的转染法、基因枪法。转染技术的广泛使用促进了 该领域及相关领域的发展。从磷酸钙到脂质体，到多胺，可用转染的 细胞种类己越来越多。转染己不再仅限于将dna转入细胞屮，rna、 sirna、蛋白质等生物人分子也进入了转染的行列。在细胞中表达外 源基因有两个关键的因素:一个是选择构建合适的表达载体和表达细 胞株，另一个就是选择合适的方法将克隆的基因导入培养细

12、胞屮进行 表达。针对不同的细胞株和不同的实验目的，需要选择合适的表达细 胞株及转染方法。(1) deae-葡聚糖法是在1965年出现的古老的转染方法2，到现在只有少数人坚 持采用带正电的deae -葡聚糖或pol沙rene多聚体可以结合带负电 的dna分子,形成的dna复物结合在带负电的细胞表面，通过使用 dms0或甘油获得的渗透休克或细胞内吞作用，使dna复合体进入细 胞。deae 一葡聚糖仅限于瞬时转染，重复性好，转染时需要去除血 清。(2) 磷酸钙共沉淀法该方法最早是在1973年开始采用，氯化钙十dma+磷酸缓冲液按 一定的比例混合，形的极微小的磷酸钙一 dna复合物沉淀粘附到细胞 膜表

13、面，借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗的大小和质量对于转染的 成功至关重要，pll值、钙离子浓度、dna浓度、沉淀反应吋间、胞孵 育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响，所 以重复性不佳。在己经很少有人采用这种方法。此法比deae法更容 易得到稳定转染，但是转染原代细胞较困难。(3) 电穿孔法通过短暂的高场强电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致 细胞膜暂时穿孔，穿过孔扩散到细胞内。电脉冲和场强的优化对于成 功的转染非常重要，因为过高的场强的电脉冲吋间会不可逆地伤害细 胞膜而裂解细胞。理论上说电穿孔法可用于各种细胞，是这种方法需 要昂贵的设备，而且由于细胞死亡率高，每次转染需要

14、更多的细胞和 dna,这种细胞电转的条件都需要进行多次优化。新霉索抗性基因和 绿色荧光蛋白基因双筛选标记的人胰岛素乳腺特异表达载体转入体 外的牛胎儿成纤维细胞，获得了用于转基因克隆牛的核供体转基因细 胞，为高效率、低成制作转基因克隆牛奠定了基础。(4) 脂质体法中性脂质体(lipid)是利用脂质膜包裹dna,借助脂质膜将dna 导入细胞月莫内。带正阳离子脂质体(catin正cliposomcs)则不同，在 优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水屮时，以形成微小的(平均大 小约1 oo400nm)单层脂质体，这些脂质体带正电，可以靠静电作用合 到dna的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离

15、子脂质 体转染的原理与利用中性脂质体转染的原理不同，使用阳离子脂质体 试剂，dna并没有预先包埋在脂质休，而是带负电的dna自动结合到 带正电的脂质体上，形成阳离子脂质体/dna复合物。阳离子脂质体 /dna复合物进入细胞是阳离子脂质体移基因的第一步，以前通常认 为脂质体与细胞膜间的融合是脂质体转移dna进入细胞的机制，而现 有证据表明复合物的整体缓慢内嗜作用才是主要的机制，这种作用通 过多糖相互作用调控。阳离子脂质体心na复合物进入细胞虽然比较 慢，但效率较高。不过，不是所有进入的基因都会发生作用。(5) 非脂质体的脂质法这是新一代的转染技术，代表着脂质体技术的未來发展方向。革 新配方成分形

16、成结构而非简单的双层膜结构，令核酸传递更有效率而 且细胞毒性也显著降低。化的树状聚合物(activateddendrimers)属 于纳米技术，高度树状分枝形成球形结构有着的大小和形状，借助每 个球体无数活化的氨基末端凝聚在dna上形成较为致密的结构，附在 细胞膜上，经过内吞进入细胞。活化的氨基可以调节胞内融酶体的 ph值，抑制降解活使得dna稳定存在。此方法转染的效率高，毒性 低，可重复性好。血清的存在能显著提高转染效率。1.3外源基因导入细胞的类型根据不同的实验冃的，外源dna导入培养细胞可分为瞬时转染和 稳定转染。瞬时转染指的是外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体 上，不整合到染色体

17、只是短暂的高水平表达，可在转染24 -%h后收 获转染细胞对转染基因的转录和复制进行分别检测表达效果。表达水 平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。超螺旋质粒转向于 瞬时表达，瞬时表达适合研究启动子等调控元件瞬时表达分别需的人 力和时间比稳定表达少，但是dna摄入效率和表达水平在不同实验中 差异较大，吋间短且不稳定。稳定转染，是外源基因整合于细胞染色体从而得到稳定的转染细 胞株，使得转染的长期表达。质粒整合到染色体上的几率很小，平均 只有万分z的几率。1.4转染细胞常采用的报告基因目的基因导入宿主细胞，不仅是导入外源基因，而且要求正确表 达。选择合适的报告基因能灵敏地、非介入性地“报告”

18、外源基因的 导入、表达过程。报告基因即完整编码区的d7a片段，当它与外源基 因被导入细胞或成体后，表达产物具有容易检测和别的特点，或者叮 以简便、快速地间接检测到目的基因的表达及调控状况。在转基因细 胞研究屮常用的报告基因主要有:荧光标记、ncor、caf等。(1) 绿色荧光蛋白(greenfluoreseentprotein, gfp)绿色荧光蛋口编码238个氨基酸，最初是从多管母中发现的-种 受蓝色光的激发可产生绿色荧光的蛋白。荧光持续时间较长，并且不 需要任何其他辅助因子的作用，能够自身催化形成发色结构，因而是 一种全能的报告基因，已广泛应用于基因的组织特界性表达、细胞分 化研究、转基因

19、动植物阳性克隆的筛选等领域的研究。(2) 红色荧光蛋白(redfluoreseentprotein, rfp)最卒报道珊瑚动物能提供各种类似gfp的荧光蛋白现己探明 dsrcd红荧光发色团单体的形成过程及单体发生有利于聚合的变化， 即过程需要分子氧，在成熟的最后一步发生了 66位氨基酸残基gh的 a位碳氮键的氧化形成氮化合物，并进一步扩展连接成红荧光发色团。(3) 新霉素抗性基因(neomycinresistaneegene, neor)新霉素抗性基因有两种，分别来自细菌转座子，编码素氨基糖普 磷酸核糖转移酶的基因，均可对氨基糖普类抗生素产生抗性。1.5影响阳离子脂质体转染细胞转染效率的因素很

20、多因素会影响阳离子脂质体转染细胞的转染效率，如被转染细 胞株种类，细胞培养环境，转染的dna、rna或者蛋白的质量和特性 等。(1) 被转染细胞被转染细胞的种类会影响到阳离子脂质体介导的基因转染效率， 但引起这种影响的目前并不清楚。脂质体复合物越易进入细胞，基因 转染效率就越高。转染前细胞最好经过1次传代，以保证细胞生长旺 盛，容易转染。贴壁细胞生长到活率为80%时就要进行下一次传代， 否则细胞就会出现接触抑制，从而降低细胞转染活力。转染吋细胞密 度对转染效率影响非常显著。不同的转染试剂，要求转染时的最适细 胞密度相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型而异。转染时 过高或者过低的细胞密度致

21、转染效率降低，甚至表达水平偏低。因此 如果选用新的细胞系或者新的转染试剂，需进行优化实验并为以后的 实验建立-个稳定方法，包括适当的接种量和培养时间等。转染时贴 壁细胞铺平率为40% 80%,但这个需要参考所选转染试剂的种类而 定。阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要90%的铺平率或者 更多的悬浮细胞数;而有些多胺或者脂质体的配方则要求在40% 80%之间。不同的实验目的也会影响转染时的铺板密度，比如细胞周 期相关基因等表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度。(2) 培养基种类健康细胞的培养是一切成功转染的基础。不同的细胞类型有不同 的特性，需要特定培养基、血清、补充添加剂等。血清一度曾被

22、认为会降低转染效率，老一代的转染方法往往耍求 转染前后洗涤细胞在无血清培养基条件下转染，这对于某些对血清要 求敏感的细胞来说是个难题。对于主流的转染试剂来说，血清的存在 己经不会影响转染效率。对于多数可以在血清条件下工作的转染试剂来说，血清的存在会 影响脂质体心na复合物的形成，但只要在na复合物形成时用无血清 培养基来稀释dna和转染试剂就可以了，在转染过程中是使用血清 的。不过对于rna转染，如何消除血清中潜在的rnase污染是值得关 注的。另外新培养基的预热对细胞转染很有帮助。支原体、细菌、真 菌污染，无论对丁细胞培养或者转染都会严重影响转染结果，细胞培 养过程中往往会添加抗生素来防止污

23、染。但是这些添加剂可能对转染 造成麻烦这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但脂质体试剂增加了细 胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这可能间接导致细胞死亡，转 染效率低。所以，对于选择脂质体转染试剂的实验，要特别注意在转 染培养基中不用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免 使用抗生素。这样，在转染前也润洗细胞。(3) 转染混合物中dna与阳离子脂质体的量阳离子质脂体具有细胞膜活性，因此可能对细胞膜或亚细胞结构 的膜结构的完整功能产纶影响，从而形成细胞毒性。脂质体/质粒复合体是阳离子脂质体进行基因转染的关键一步， 两者的比例对基因转率有重要的影响。不同的阳离子脂质体有其最佳 的dna结合量比

24、。有作者认为阳离子脂质体正电荷与核酸的负电荷在 1:1或以上时，核酸转运的效果最佳，在体外转染中，优化的电率常 常大于1,而体内转染吋其比率接近1较好。体外转染试验表明，阳离子脂质体dosper与dna,lipofectamine 与dna比例为7.5:1（均为重量比）吋，可获得最高的转染效率，用量 高非但不会提高转染率，还会增加细胞毒性。2研究目的和原理2.1月元蛋白研究目的和意义传染性海绵状脑病的病原是航病毒，它一种具有传染性、抗蛋白 酶水解的、含有gpi锚定位点的糖蛋白，同吋还具有同普通病原微生 物不同的理化和生物学特性肮蛋白基因结构及其编码蛋白的序列在 不同哺乳动物之间高度保守，由此看

25、出机体止常的月元蛋白具有重要的 生理作用.研究表明，机体正常的月元蛋白参与神经系统功能的维持、 参与铜离子的代谢等重要作用肮病毒是由机体正常的月元蛋白转化而 来，其理化和牛:物特性恰恰与正常肮蛋口相反，因此研究机体正常月元 蛋白的结构功能和凶萨转变为prpsc的机理已经成为研究传染性海绵 状脑病的热点。另外研究发现，月元病毒存在种间屏障现象，表现为致 病性航病毒在繁殖过程中存在种属特异性和株系特异性的现象，而且 反蛋白基因的多态性与动物对海绵状脑病的易感性相关动物传染性 海绵状脑病如疯牛病的全球暴发给人类健康和食品安全带來极大的 隐患，各国科学家致力于该病的发病机理的研究，但是到目前为止， 科

26、学界仍然没有确定机体正常航蛋白的生理作用和异常月元蛋白的致 病机理。2.2国内外研究现状传染性海绵状脑病或航蛋口疾病包括人的克一雅氏病、致死性家 族火眠、吉斯综合征、库鲁病、牛的海绵状脑病、羊的痒病、鹿的慢 性消耗性疾病及水貂的传染性水以貂脑病等。这是一组或一类疾病， 其共同特征是：潜伏期长达数月至数年，甚至致十年或几十年；机体 感染阮病毒后不发热，不产生炎症，无特异性免疫应答；这类疾病可 分为家族性、散发性、医源性三种类型，且均可由人工感染实验动物, 但大多数反病毒病在自然条件下不能进行水平传播；这类疾病的共同 症状是；临床上呈现进行性共济失调、震颤、姿势不稳、痴呆、知觉 过敏、行为反常等神

27、经症状，病程发展缓慢，但最终以死亡告终。组 织病理学变化主要集中在中枢神经系统，主要表现为神经元空泡化， 灰质海绵状病变、神经元丧火、星形胶质细胞增生，月元病毒蓄积和淀 粉样蛋白斑块。传染性海绵状脑病已经给人类生命安全、食品安全和世界畜牧业的生产带来极大的威胁.3脂质体介导cho细胞转染3. 1材料3. 1. 1细胞系中国仓鼠卵巢上皮细胞(cho)3. 1.2质粒表达载体pbac a3neo十a3egfp、辅助质粒pha3pig3. 1.3主要试剂、药品、培养基试剂：脂质休lipofectami nerm2000,购白北京拜尔迪生物工程公司；g418, amresco公司产品，贿自北京索莱宝公

28、司；红0. 029；调节ph7 2-7. 4,过滤除菌备用。台盼蓝: 购自中国农业大学供应科，储存浓度4%,使用浓度04 %固定液：4%多聚甲醛甘氨酸漂洗液：ioomm/l,用 dpbs配制冲洗液：dpbs,每升溶液中含cac12 0. 109、kc10. 209、mgc12 6h20 0. 109, nacl 8. 009、na2h *711202. 169调节ph74, 4c保存.封闭液：5%正常山羊血清 抗荧光淬灭封片剂：碧云天公司培养基：dmem培养基，无血清optimem, gibeo药品：青霉素、链霉素购自jb京博大泰克公司胎牛血hyclon 公司产品；d-hank? s:每升溶液

29、屮含naci 89、kc1049、na2hp040. 069、1 (tij2p040 069、nahc030 359。 双抗：以pbs或d-hank's配制，过滤除菌。储存浓度为 10万u,使用浓度为i00u/ml；抗体稀释液：含50/, 山羊血清的dpbs；抗prp单抗be12,英国tse research centero羊抗小鼠igg,罗丹明标记，购自北京中衫生 物工程技术公司。3.1.4主要仪器设备 细胞用倒置显微镜(重庆光学仪器厂) 医用超净工作台(hdl)； c02细胞培养箱(r本三洋)； oliymptb倒置荧光显微镜；激光共聚焦扫描显微镜(fv500) 超低温冰柜：.80

30、 cult freezer 702 高速离心机：beckman产品 冷冻台式离心机：eppendorf产品 全自动高压锅：aut0clavemls-3750 dk8d电热三相恒温水槽，上海跃进医疗器械厂3. 2材料制备方法和步骤3.2. 1ch0细胞制备(1) cii0细胞简介ch0细胞是中国仓鼠卵巢细胞，是目前生物工程上广泛使用的细 胞系。真核细胞屮ch0细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系： 因为与其他表达系统相比，它有许多优点： 具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分 子结构、理化特性和生物学功能方面接近于天然蛋白分 子。 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化 具有重组

31、积阴德高效扩增和表达能力 具有贴壁生长特性，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以 进行悬浮培养，表达水平较高 ch0细胞属于成纤维细胞，很少分泌口身的内源蛋白，利于外 源蛋白的分离ch0细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器 中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有 显著差别：动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低， 对剪切力敏感，适应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生 物污染，培养时需用抗生素；培养过程需氧量少（氧传质系数kla大 于10h-l即可满足每毫升107个细胞的生长）；培养过程中细胞相互 粘连以集群形式存在；原代培养细胞一般繁殖5

32、0代即退化死亡；代 谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。（2）培养基的组成dmem培养基组成序芍化合物名你含量（tng/l）序号化合物名称含 ft (ag/l)1无水象化钙200. 0017l 丝氨战42. 002硝酸铁.9112 0 0. 1018l-苏氨酸95.003氯化钾400. 0019l 色氨酸16. 004无水硫.战伐97.6720l 昭氮战钠盐104. 005氯化钠6400. 0021l-蠟氨酸94.006无水确战二氢铁125. 0022d 泛酸钙4. 007l 盐酸精氨感84.0(123氨化胆織4. 00863 0024叶战4. 009l-谷氨風胺5840025肌醇7

33、. 2010甘氨酸30. 002b烟酹胺4. 0011l-盐酸组氢酸42.0027孩黄素0. 4012l-异亮氨酸105. 0028盐酸就，腋40013l-亮氨酸105. 0029昔酸毗哆辛4. 0014l權酸轶氨酸146. 00301000. 0015l-甲毓氨酸30. 0031丙附酸紡110. 0016l-苯丙氨酸66. 0032酚红15.00将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培 养基洗下，并入容器。加注射用水（水温2（t30°c）至0 950毫升，轻 微搅拌溶解。 加入2. 438克碳酸氢钠 轻微搅拌溶解，加注射用水至一升 用lmoll氢氧化钠溶液或lmol

34、l盐酸溶液调ph至所需值 用0. 2um滤膜正压过滤除菌 溶液应在2°c8°c下避光保存(3) 培养皿处理玻璃器皿一般需用清洁液浸泡广7天，清水冲洗20次后再用蒸 憾水洗两次，烤干备用。用hu 160°c高温消毒2小吋后使用。96孔或 24孔塑料板一般用2%naoh浸泡4小时后，清水洗净再用in hcl浸 泡4小时，用清水冲洗后再用蒸僻水漂洗，37°c干燥后，紫外线灯照 射消毒。新橡皮塞须用1/2naoh煮沸15分钟，洗后再用4%hcl煮沸 15分钟，清水冲洗后用蒸镰水洗5次，煮沸10分钟灭菌，或送高压 锅灭菌。(4) ch0细胞培养细胞培养方法包括固定

35、化培养方法、微载体细胞培养法，本实验 用微载体培养微载体细胞培养法是一种用于培养依赖性细胞的大规模培养技 术。这种技术在牛物反应器内加入培养基和-种对细胞无毒害作用的 材料支撑的颗粒(微载体)，使细胞在微载体表面附着和生长，并通 过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。原理；其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的 培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续 搅动使微载体始终保持悬浮状态。细胞只有附着在固体基质表而才能增殖，故细胞在微载体表面的 贴附是进一步铺展和生长的关键。粘附主要是靠静电引力和范徳华 力。细胞能否在微载体表面黏附，要取决丁细胞与微载体的接触概率 和相容性

36、。(5) cho细胞无血清驯化取处于对数生长期的贴壁cho细胞，活率人于95%,开始进行 无血清驯化。细胞驯化在转瓶中进行。将无血清细胞培养基和韩雪晴 培养基的按1:1(v/v)的比例进行混合，接种密度为2x105cells/ml 的细胞，在37%、5%c02培养箱进行培养。根据细胞生长和活率情况，在降血清的每一个阶段可稳定传代 1-3代，接种密度维持在2x105cells/mb逐步提高无血清细胞培养 基在混合液中的比例，即降低混合液中的血清含量，传代过程的细胞 接种密度仍维持为2-3x105cells/ml,直至混合液中的血清浓度降 低至0. 1-0.2%,每一代的细胞活率大于90%后，此时

37、可将细胞完全 培养在ciio无血清无动物组分培养基中-在cii0无血清无动物组分培 养基中进行放大培养，建立起适应无血清无动物组分培养的ch0种子 细胞库。具体操作如下： 以2倍正常接种密度接种生长活跃物到75%有血清培养基： 25%saf-ciio-g-004细胞培养基中，传代培养。 当细胞密度大于5 x 105cells/ml时，有血清培养基 saf-ch0-g-004细胞培养基为50:50的混合培养基中传代培养。 以2x106到3x106cells/ml, 25%有血清培养基和75%saf-ch0-g-004细胞培养基中传代培养。 当细胞密度到1 x 106到3x 106cells/ml

38、 （接种后4到6天）, 在100%saf-ch0-g-004细胞培养基中传代培养。 每隔3到5天,当1x106 glj3x106cells/ml,细胞活率在90 %时，储备的适应了无血清培养基应该再次传代培养。将上述ch0细胞（成功用无血清驯化后的细胞）用0. 25%酶消 化制成细胞悬液后，用培养基调整接种细胞浓度为3x105cells/ml. 沿导流管加入含明胶微载体和saf-cho-g-004细胞培养基的whcltonbioster 瓶罐中 37°c, 50r/min 搅拌 30 分钟。37°c, 50r/min 搅拌2分钟再精致24小时（利于细胞贴附）。37°

39、;c, 50r/min持续 搅拌培养每天换液1/23/4量，并取样23nil,行染色技术连续培养 3天细胞在明胶微载体上生长良好，经计数可达lx106cells/nd细 胞浓度，扩增了 3倍，基本达饱和密度，此时可以消化传代，进行扩 大培养。（6）活体染色台盼蓝活体染色简单易行，是常用检查细胞存活的方法，用台盼 蓝染液，然后可见死细胞染成均匀的蓝色，活体细胞不着色。（7）细胞计数用血球计数板做细胞计数。根据情况用营养液稀释与否均可。做法是 用习惯吸取少许染色的细胞悬液滴于计数板上，使悬液自由充满盖片下方间隙。稍后片刻，镜下观察并计算出u!角大格内的细胞数，压线只计上线和右线的细胞，然后按下式计

40、算出细胞浓度：细胞数/ml原液二四角大格内的细胞总数/4*10000*稀释倍数。3.2.2脂质体制备(1) 脂质体简介脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成的，磷脂分子在 水肿可自动生成闭合的双层膜，从而兴城一种囊状物被称为脂质小 体，最初人们只是运用脂质体膜的构造极其功能，从而发现了膜的融 合及内吞作用。最早闹革命脂质体能把dna十分有效地引入动物细胞 的实验是从鼠/人杂种细胞系(hgprt -)中分离出的中期染色体包裹 到脂质体中，并用以转染hgprt -的细胞，结果转化率比裸露杂色体 高十多倍，而且转化子能稳定地表达hgprt的活性。脂质休法具有 很多优点，操作简便，转化率比较高，可

41、以用于瞬间转染，也可以用 在永久表达系的建立，对细胞类型的运用面广，对转染的核酸类型和 分子量有很高的包容性，细胞毒性小，也可以用于体内的基因转染， 因此脂质体转染发得到了越來越广泛的应用。(2) 脂质休的组成和制备脂质体的组成磷脂是一种双亲(亲水亲脂)脂分子，在水环境中可自发地兴城 双层膜,bangham首次鉴定了呈微球形的脂类双份子层。制备脂质体 的主要材料是天然磷脂和类固醇，因而是牛物可降解的、无敌的和不 致免疫的。脂质体的种类很多，概括起来有多层脂质体和单层脂质体, 通常使用“囊泡” 词來描述不同类型的脂质体，例如有多层大囊泡 (mlv)、单层巨型囊泡(guv)、单层大囊泡(luv)、

42、单层小囊泡(suv) o不同组成的脂质体其表面电性会不同，表而电荷为阳性、阴性和 中性的脂质体对细胞的转染频率也会有差别。现存的商业化脂质体均 为阳离子脂类与屮性脂类的复合体，女nlipofect> amine> lipofectin 等，中性脂类多位二油酰磷脂乙醇胺(dope),其中阳离子脂类起主 要作用，通过静电作用与dna形成dna-脂复合体，并引导dna进入细胞, dope起辅助作用，去稳定脂质和胞内促dna释放，称为辅助脂类。阳离子脂质体主要分为三类：(1)人工合成的阳离子去垢剂与 dope组成，它有两条疏水碳氢链和一个季钱离子极性头部。如 lipofectirio (2

43、)天然脂经过修饰接上一个阳离子基团与dope组成, 如胆固醇共价接个二甲基乙基甲酰胺或磷脂酰胺接聚赖氨酸或多 胺。(3)天然碱性脂与dope组成，如硬脂胺(sa)为已知的唯一纯天 然的脂类。脂质体的制备方法脂质体的制备主要有超声波法、磷脂酰丝氨酸ca2+离子融合法和 逆相蒸发等，用超声波法可制备的单层或多层脂质小体能向细胞内引 入的物质量少，故常用后两种方法制备大的脂质体。(3) 脂质体介导转染的机制阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用， 将dna分子包裹入内，形成dna-脂复合体，也能被表面带负电荷的细 胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞食、作用进入溶酶体。内吞后dma-脂复合

44、体在细胞内兴城的包涵体，在dope作用下，细 胞膜上的阴离了脂质因膜的不稳定而失去原油的平衡扩散进入复合 体，与阳离子脂质中的阳离子兴城中性离子对，实原来与脂质体结合 的dna游离出来，进入细胞质，进而通过核孔进入细胞核，最终进行 转录并表达。辅助脂质体dope含乙酰胺头部，在溶液中形成六角形引起脂质高 度玩去，对脂双层具有去稳定作用，可使细胞膜和包涵体膜去稳定， 在dna-月旨复合体的内吞和dna从包涵体的释放两个关键步骤中起作 用。（4）增加转染效率的添加剂脂质体-dna复合体中加入一些阴离子物质能促进复合体与细胞 膜的融合或dna的释放。在dna与脂质体混合前预先用磷酸盐缓冲液处 理脂质

45、体能提高喊荧光索酶基因的dna和mrna质粒转然后的荧光素酶 的表达量，分别为26倍和56倍。硫酸精蛋白（usp）是一种聚阳离子 多肽，它是通过精蛋白分子中精氨酸残基浓缩质粒dna来增加转染率, 这种作用力的大小与精蛋白的结构有关，与其所带电荷无关。一些短 链磷脂促进双亲多肽介导的转染，如在短杆菌肽s与dope混合物转染 细胞时加入磷脂酰胆碱能使0 -gal的表达量增加6倍，且无毒性。ca2+ 能促进膜对dna-脂质体的吸收，habcrland的体外转染实验表明，ca2+ z所以能促进转染是由于形成了磷酸钙微小沉淀,能促进dna-复合体 的运输和从包涵体膜内的释放、2%-6%聚乙二醇（peg）

46、可诱导各种粒 了的聚合，从而增加膜的内吞作用，dma-复合体与细胞膜的结合力提 高100倍；人的血清蛋白包白通过静电吸附或受体介导而吸附于脂质体表面，可抵抗高浓度血清（60%）的抑制作用（10） o3.3 dna与脂质体最佳比率的确定用脂质体转染细胞的过程中，需要注意的是对不同的细胞类型要 摸索合适的dna/脂质体配比、剂量和转染时间，其屮dna与脂质体的 配比是关键。内蒙古人学实验动物研究中心通过脂质休（fugene-6） 介导，将真核表达载体pegfp-cl （绿色荧光蛋口基因）成功导入体外 培育的牛胎儿成纤维细胞。实验发现gfp基因的表达随dna/脂质体量 的增加而增加。延长细胞暴露时间

47、反而转染率下降，转染细胞数适当 才能得到较高的转化率。加放射性dna和染色体结合的比例。另一个相似的实验报道了包 裹在带负电荷的luv中的大肠杆菌rna可以和胡萝卜原牛质体相连接。 3.4确定g418最佳浓度用005%胰蛋白酶消化ch0细胞，调整细胞密度为1x105,接种 24孔细胞培养板，培养24h；将g418配成终浓度为200mg/l> 300 mg, l、400 mg, l, 500 mg几、600 m巩、700 mg / l> 800 m班，900 mg /l：细胞换液，加入含不同浓度（418培养基，每个浓度做三个重复, 以后每隔3天半量换液，每日倒置显微镜r观察。3.5转

48、染内容和步骤3.5.1试验方法简述通常，gfp在完整并形成正确构象时能够产生荧光，这个性质使 得它在蛋白质研究中具有极其重要的作用。gfp被广泛地用作靶蛋白 指示分子.通过gfp基因与靶蛋白基因融合，来研究蛋白质相互作用、 构象变化，蛋白质折叠效率与可溶性，蛋口质的表达以及细胞定位 等.作为报道分子。gfp具有很多优点.如实现了活细胞内基因表达和定位，荧光为 蛋白质的内在属性、荧光发射无种属依赖性、检测时不需要附加 辅助因子、具有高度稳定性等。另外，细胞内gfp的检测也比较简单。 如利用紫外灯、荧光显微镜，荧光激活细胞分选仪等。利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒 的比例，

49、细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影 响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提 高有巨大的作用。将其转入中国仓鼠卵巢细胞(chol荧光显微镜观察、抗p精异性抗 体鉴定，得到了稳定表达绵羊prp基因的cho细胞系。对此细胞系的进 一步研究发现。外源导入cho的绵羊prp可以在cho中稳定表达。3. 5. 2脂质体法转染cho转染前24h,以胰蛋向酶消化cho接种于24孔细胞培养板中，每 孔1x1矿一!xlo,个细胞培养在500 “l无抗生素的培养液中，转然前 细胞达到95%汇合。最佳dna和脂质体转染比例确定：根据dna和 lipofcctaminc2000的

50、比例不同进行分组.dna (ug): 1 ipofectamine (ul)分别为 1： 1 > 1: 2、1： 3, 1： 4 1： 5和空白对照组。每组设3个重复。转染步骤按说明书进行。转染 细胞在37c, 5%c02培养箱培养。转染不同吋间置于(荧光显微镜) 显微镜f进行细胞形态学观察，确定dna与脂质体哪个比例f细胞转染 成功率最高。得出转染的最佳比例后进行转染实验。试验分6纽：空白对照组，脂质体转染pegfp组，脂质体转染pegfp-ovprp组，脂质体转染pegfp-ovdpl组，不加脂质体的 pegfp-ovprp,不加脂质体的pegfp-ovdpl组。转染步骤同上.转染不

51、 同时间进行光镜观察并照相。转染24h后，按1： 10稀释细胞，接种到含g418的选择性培养基 （2550ml培养瓶），48小时内杀死阴性细胞，然后传代,接种6孔板, 4实验结果观察鉴定4. 1荧光显微镜下观察转染后24h在荧显微镜下观察转染效果，并计算转染效率。因为 我们所构建的真核表达载体含有gfp绿色荧光蛋白报告基因，如果转 染成功，被转染基因得到表达。在荧光显微镜下可看到绿色荧光，否 则。不产生绿色荧光.4.2 pefgp_0vprp的免疫荧光鉴定转染后的ch0细胞经选择培养后，用吸管小心吸去培养液，加入3n）l预热至35c的dpbs漂洗细胞，重复一次；用含03%戊二醛的4 %多聚甲醛

52、固定细胞，室温固定15min,吸去固定液，另加入3ml新的 崗定液，室温下再固定ismin：用溶于dpbs的loommol / l甘氮酸溶液 漂洗30raino吸去廿氨酸漂洗液，用dpbs洗3次；加入封闭液，室 温封闭30min；去除封闭液，加入0sml经1： 500稀释的抗prp抗休， 室温反应lh或4c过夜；吸去抗体反应液，用含0. l%tritonx. 100 的dpbs漂洗三次，每次10min；加入0. 5ml!： 200稀释的二抗，室温 反应lh；吸去二抗反应液，用dpbs漂洗2次，稍晾干后，用抗荧光淬 灭封片剂封片，荧光显微镜下观察结果。4. 3光学显微镜观察对脂质体介导的质粒转染

53、在不同的时间段观察，正常cho细胞成 圆形或椭圆，有的呈不规则三角形，细胞生长良好、饱满。转染8h 后，个别细胞边缘不整齐，高倍镜下可见胞质那内有颗粒状物。转染 绵羊prp 24h后，有的细胞表面出现空洞，这些细胞随时间延长，细 胞体积变小。皱缩。最后悬浮在培养液中死亡。转染空质粒的细胞和 只加脂质体的细胞无明显变化.4.4荧光显微镜观察围5-8转染腊质体的cho细胞24h, fig 5-8 choi io transfectedwith lipofactami fie,我们所构建的真核表达载体中带有egfp（=3,强型绿色荧光蛋白）的报告基因，转染后，荧光显微镜下观察细胞有 绿色荧光，激发波

54、为488m。转染24h小时后，荧光显微镜下观察转染 的效果。在20x10镜头下观察到脂质体转染pegfp组有绿色荧光产生, 阳性对照组成立；空口组和阴性对照组（只加脂质体）看不到绿色荧 光；脂质体转染pegfp-ovprp组、脂质体转pegfp-ovdpl组均强绿色荧 光出现。说明转染成功。明场观察转染pegfp 24h的cho细胞荧光显微镜下观察转染pegfp 24h的clio细胞荧光下观察转染明场观察转染pegfp-ovprp 24h的cho细胞pegfp-ovprp 24h 的cho细胞明场观察转染脂质体24h的cho细胞6实验数据分析5.1转染效率计算荧光下观察转染脂质体24h的cho

55、细胞直接在荧光显微镜下随机采三个视野，计算发绿色荧光的细胞数占总细胞数的百分率即为转染效率.计算公式：转染效率（）=（三个视野发绿色荧光的细胞总数口） /（三个视野总细胞数，3）x100o5. 2转染效率和转染效果随机在荧光显微镜（40x 10镜头）下捕捉三个视野，利用image composition图象重合软件重合明场和荧光下的细胞图片，计算空载 体、pegfp-ovprp, pegfp-ovdpl的转染效率。由表可以看出，空载体和pegfp-ovprp的转染效率大于65%, pegfp-ovdp的转染效率最低，不到50%。表示在同一倍数下，同一视 野下明场与荧光背景下转染空载休载体、pegfp-ovprp. pegfp-ovdpl 的细胞重合图，从图片可以看出，各质粒dna的转染效果良好，可以 用于进一步的实验。5. 3g418最佳筛选浓