树突状细胞-转移癌融合疫苗治疗转移性结肠癌研究1

1、1树突状细胞/结肠转移癌细胞融合疫苗治疗转移性结肠癌的动物实验研究孙新平，丁晓煜，赵文鹏,朱宗迅，李渊，张天锋(武警甘肃总队医院医务处 甘肃 兰州730050)【摘要】目的：通过建立人免疫重建荷人结肠癌皮下种植瘤严重联合免疫缺陷 (scid)小鼠模型，研究dc/结肠癌融合疫苗对人转移性结肠癌的发展及预后的影 响。方法：应用腹腔注射法对严重联合免疫缺陷scid小鼠注射人外周血淋巴细 胞(hu_pbl)免疫重建后，皮下注射法建立荷人结肠癌皮下种植瘤模型。应用 聚乙二醇(peg)制备dc/sw620融合疫苗。将dc/sw620融合疫苗于左、右后足 底、尾根部皮下三点注射在人免疫重建的scid小鼠结肠

2、癌皮下移植瘤模型。酶 联免疫吸附试验(elisa)检测小鼠血清中人igg含量；通过直接测量法观察人 结肠癌皮下种植瘤成瘤性和小鼠牛存期。结果：融合疫苗治疗组的皮下肿瘤体积 生长速度慢于其他各对照组；融合疫苗治疗组生存期为(10900±17. 17) d,明 显长于单纯制模组(55. 67±12.03, /k0. 001)、免疫重建组(81.83±9.06, p< 0.001)、肿瘤细胞疫苗组(87. 33±12.85, /k0.01)o结论：dc/sw620融合疫苗 可抑制肿瘤牛长，改善预后，dc/sw620融合疫苗比肿瘤细胞冻融物免疫治疗效 果更

3、佳。关键词结肠癌；树突状细胞；细胞融合；严重联合免疫缺陷小鼠中图分类号r392.12 文献标识码a结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率在西方发达国家分别居恶 性肿瘤的第3位和第2位山刃o目前除外科手术、化学疗法和放射疗法外，免疫治疗作为辅助治疗新途径，日益受到研究者的关注。它治疗的靶点和毒性作用与 传统治疗措施没有重叠，靶向性好，产生的记忆性免疫效应细胞可预防肿瘤复发。 其中树突状细胞/肿瘤细胞融合疫苗在针对多种恶性肿瘤的研究中取得了抗肿瘤 作用2'3_510本研究拟通过建立人免疫重建荷人结肠癌皮下种植瘤scid小鼠模型, 研究dc/结肠转移癌融合疫苗对人结肠癌发展以及预后的影

4、响。1材料和方法1.1材料scid小鼠：无免疫渗漏(iggv 1 ug/ml)的c.b17/scid纯系小鼠，雄1作者简介：孙新平(1962),男(汉)，卄肃秦安，主任医师，硕士，胸心外科专业。2联系地址：兰州市龚家湾建兰新村251号武警医院医务处，电话 e-mail:sunxinping2性，46周龄，30只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于无特殊 病原体（spf）环境（北京大学医学部动物实验中心），饲料、饮水、垫料等均 经无菌消毒。人结肠转移癌细胞株sw620由上海细胞所购入。健康人浓缩口细 胞，购自北京市红十字会中心血站。50%聚乙二醇（peg）购自

5、sigma公司（美 国）。人igg elisa试剂盒购自pierce公司（美国）。其他试剂为市售高级试剂。 1.2方法121人外周血淋巴细胞（hmpbl）及dc的分离培养：用淋巴细胞分层液密度 梯度离心法从健康人浓缩口细胞中分离出人外周血单个核细胞，以含5%人血清 的rpmi1640培养，24h后吸取未贴壁细胞（主要为淋巴细胞），用rpmi1640+5% 人血清培养，并加入20u/ml il-2培养24小时后用以对scid小鼠的免疫重建； 贴壁的细胞则继续用rpmi1640+5%人血清培养，并加入1000u/ml rhgm-csf和 1000u/ml il-4,培养第6天加入tnf- a 80

6、0u/m 1使树突状细胞成熟。122 dc/sw620融合疫苗的制备：结肠转移癌细胞株sw620以含5%胎牛血清 的rpmi1640培养，常规换液传代。dc与sw620细胞按1:3的比例混合，室温 下用peg融合法融合。1.1.3免疫重建荷人结肠癌皮下移植瘤模型建立及治疗：（1）实验分组：将30只 scid小鼠随机分为a假手术组、b单纯制模组、c免疫重建组、d融合疫苗治 疗组、e肿瘤细胞疫苗组五组，毎组6只。（2）腹腔注射法免疫重建：在第1周,c、d、e组腹腔注射300 pl含3xl（）7hu_pbl的pbs, a、b组腹腔注射等量不 含hu_pbl的pbso （ 3）皮下注射法建立结肠癌皮下

7、种植瘤模型：第2周，b、c、d、e组小鼠于右腋下注射150 pl含5x106sw620细胞的pbs, a组小鼠注射 不含sw620细胞的等量pbso （4）皮下注射法免疫治疗：dc/sw620融合疫苗 和sw620细胞冻融物在注射前经过co-60射线30 gy剂量照射，以杀灭其中残 留的肿瘤细胞。第3周，d组在左、右后足底、尾根部注射含1 x 107dc/sw620 融合疫苗的pbs每部位50 pl, e组于相同部位注射含1 x 107sw620细胞冻融 物的pbs毎部位50 pl第4周、第5周d、e组重复上述治疗，共3次。124皮下移植瘤模型的疗效评估：b、c、d、e组制模后毎周测量小鼠皮下

8、瘤 的最氏径dmax和最短径dmin,体积v=0.52xdmin2 xdmax。记录各组小鼠的 生存期。125免疫重建效果的测定 每组每只小鼠在第5周时剪尾取血20 pl/只，分离 血清，用elisa方法检测人igg含量。1.2.6统计学处理 利用spss 10 for windows软件进行单因素方差分析。当x0. 05认为有统计学意义。2结果 2.1用腹腔注射法成功建立模拟人类免疫功能的模型 应用elisa方法在免疫重 建后第5周的小鼠血清中检测到了人igg, c组、d组、e组阳性均为6/6。但各组之间igg水平无显著性差异（表1）。表1 scid小鼠血清中人igg表达情况（elisa法）

9、分组n人igg水平mg/mla （假手术组）0/60b （单纯制模组）0/60c （免疫重建组）6/6335.91±58. 66d （融合疫苗治疗组）6/6326. 27±48. 23e （肿瘤细胞疫苗组）6/6337. 07±86. 422.2 dc/sw620细胞融合瘤疫苗可抑制皮下肿瘤的生长，明显延长治疗组的生存期。2.2. 1每只建模小鼠都长出了皮下瘤（图1）。图1 dc/sw620融合疫苗对结肠癌皮下种植瘤的影响。（a假手术组b单纯制模组；c免疫 垂建组；d融合疫苗治疗组；e肿瘤细胞疫苗组）2.2.2 dc/sw620融合疫苗治疗组曲线低平，提示与其他3

10、组相比，此组小鼠皮 下瘤生长受到抑制。（图2）1200010000aoooaooo40002000o34 s 6789 io 11121314 ie 1617181920时冋c ）图2 dc/sw620融合疫苗对结肠癌皮下种植瘤生长的影响。（b单纯制模组；c免疫重建纟r；d融合疫苗治疗组；e肿瘤细胞疫苗组）2.2.3 dc/sw620融合疫苗可明显延长荷人结肠癌皮下种植瘤小鼠生存。融合 疫苗治疗组生存期为109. 00 +17. 17天，明显长于单纯制模组（55.67±12.03, 広0. 000）、免疫重建组（81. 83±9. 06,尺0. 002）、肿瘤细胞疫苗组（8

11、7. 33±12. 85,do. 010）。（表 2,图 3）*与b组比较*与c纽比较*与e组比较#与b组比较表2 dc/sw620融合疫苗对结肠癌皮下种植瘤模型牛:存的影响分组n生存期（天）卩值b （单纯制模组）655. 67±12. 03c （免疫重建组）681.83±9. 06p 1=0.000*d （融合疫苗治疗组）6109. 00±17. 17p2=0.002*p3=0.010* *e （肿瘤细胞疫苗组）687. 33±12. 850.000#图3 dc/sw620融合疫苗对结肠癌皮卞种植瘤模型牛存的影响。（a假手术组；b单纯建模组；

12、c免疫重建组；d融合疫苗治疗组；e肿瘤细胞疫苗组）3讨论dc/结肠癌融合疫苗能有效抑制结肠癌的发牛发展。本研究室前期研究成功 构建了异源dc与结肠癌细胞的融合并口成功诱导出cd4+t细胞和cd8+t反应，ctl对结肠癌靶细胞的杀伤效力高于传统的lak细胞疫苗和til细胞疫苗，融合 疫苗可以诱导结肠癌细胞凋亡5,8_9。本研究利用dc/sw620融合疫苗治疗结肠 癌皮下移植瘤模型，取得了较理想的效果，dc/结肠癌细胞融合疫苗可发挥抑制 肿瘤生改善预后的治疗效果。将肿瘤细胞和dc融合，能充分发挥dc作为抗 原提呈细胞的作用，有效地激活抗肿瘤免疫应答。通过融合过程，产生的融合细 胞能在dc介导的共刺

13、激作用下将广谱的肿瘤相关抗原提呈给t细胞。尤为重要 的是，肿瘤细胞的抗原可以作为融合细胞产牛的内源性肽通过mhci类途径提呈, 同时也可以与mhc ii类分子结合而诱导th cd4+t细胞免疫反应。其他抗原负载 dc的方式多是单一的激活mhc i类或ii类分子介导的免疫反应，融合细胞独具 同时激活cd4+t细胞和cd8+t细胞的能力。由此产生的细胞毒性反应与辅助性t 细胞反应的协调作用，对于抗肿瘤免疫的有效性和可持续性至关重要e10odc/结肠癌融合疫苗比结肠癌细胞冻融物有更强的抗结肠癌细胞作用。本研 究比较了 dc/结肠癌融合疫苗和结肠癌细胞冻融物的治疗效果。结果发现，虽然 结肠癌细胞冻融物

14、对结肠癌也能起到一定的抑制作用，但效果都不如dc/肿瘤融 合疫苗更理想。肿瘤细胞冻融物不具备dc的抗原提呈功能，不能持续提供抗原, 特异性差。dc/肿瘤细胞融合疫苗具有肿瘤细胞冻融物不具备的优势：融合疫苗 能自然加工抗原性肿瘤蛋白，并以mhc-i类复合体的形式提呈到细胞表面；融合 疫苗能促进dc的功能，能为mhc-i类复合体的提呈提供连续的内源性肿瘤抗原 11-12o近年来，应用dc/肿瘤细胞融合疫苗治疗恶性肿瘤，被广泛研究并部分应用 于临床治疗，取得了一些成绩，但同时也发现了一些问题：目前通用的体外诱导 和培养dc的方法耗时、费力、价格昂贵，不能规模化生产，且易被污染，i、的不 能广泛应用于

15、临床。相信随研究的深入，dc/结肠癌细胞融合疫苗有望成为治疗 结肠癌的新有效途径。参考文献1 feng xu,ying-jy, wei liu, et al. against colorectal cancer liver metastasis inscid micef j.scandinavian journal of gastroenterology june, 2010, 45(6): 707-713.2 ahmedin j, rebecca s, elizabeth w, et al. cancer statistics 2008. j cancer clin,2008,58:71-9

16、6.3jhaenssle ha, krause sw, emmert s, et /.hybrid cell vaccination in metastatic melanoma: clinical and immunologic results of a phase i/ii studyj. j immunother. 2004,27:147-55.f4chen d, xia j, tanaka y，et al. immunotherapy of spontaneous mammary carcinoma with fusions of dendritic cells and breast

17、carcinoma by prophylactic vaccination with dendritic/tumor fusion cellsjj. j immunol, 2003,170:1980-1986.5 gong j, nikrui n, chen d, et al fusions of human ovarian carcinoma cells with autologous or allogeneic dendritic cells induce antitumor immunity j. j immunol,2000,165:1705-1711 6 xu f,ye yj.cui

18、 tr.et /.allogeneic dendritomas induce antitumour immunity against metastatic colon cancer.scandj j immunol,2005,61:364-369.7 niu g,heller r,catlett-falcone r.et al.gene therapy with dominant-negative stat3 suppresses growth of the murine melanoma bi6 tumor in vivo jj.cancer res,1999,59:5059-5063.8 donald e, mosier.richard j. et /.transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency.nature98&335:256-259.9 xu f, ye yj, wang s. in vitro antitumor immune r