白藜芦醇对豚鼠心室肌细胞L

1、白藜芦醇对豚鼠心室肌细胞L作者：易方方，唐其柱，冯斯婷，王腾【关键词】白藜芦醇；全细胞膜片钳；钙电流Effects of resveratrol on Ltype calcium current in isolated ventricular myocytes of guinea pig【 Abstract 】 AIM: To investigate the effects of resveratrol on theLtype calcium current (ICaL) inisolated ventricularmyocytes ofguineapig. METHODS: Single v

2、entricular cell was obtained from healthy guineapig heart usingenzymatic dissociationmethods. The wholecellpatch clampwas used to record the ICaL following the administration of resveratrolat 1, 50, 100mol/L. RESULTS: Resveratrol reduced the ICaL in aconcentrationdependentmanner, butit had no effect

3、on IV shape of ICaL. Resveratrolmarkedlyshiftedthesteadystateactivationcurveof ICaLto the right,and V1/2 valueincreased from (- ±)mVin control to ( - ±)mV in the presence of resveratrol（n=7, P= ）, the value from (±) to( ±) (n=7 ，P=). Inactivation curve of ICaL was not affectedsig

4、nificantly. The time constantof reactivationof ICaLwas reducedfrom ( ±) ms to( ±) ms (n=6，P=) by resveratrol.CONCLUSION:Resveratrolinhibited the Ltype calcium channel, mainly acting on the activity andrecovery processes.【Keywords】 resveratrol； wholecell patch clamp； calcium current【摘要】 目的：

5、研究白藜芦醇对正常豚鼠心室肌细胞L 型钙电流（ ICaL）的影响 .方法：采用全细胞膜片钳技术 , 记录不同浓度白藜芦醇作用前后对 ICaL的影响 .结果：白藜芦醇呈浓度依赖性阻断 ICaL, 但对激活电位、峰电位、反转电位均没有影响； 白藜芦醇使 ICaL 稳态激活曲线右移， V1/2 由对照的（- ±）mV变为（ - ±） mV （n=7，P=）， 由（±）变为（±）（ n=7，P=）；对失活曲线无影响，不改变 ICaL 失活特性； 白藜芦醇使 ICaL 失活后再恢复时间常数 缩短，从（±） ms 变为（±） ms（n=6， P=

6、）. 结论：白藜芦醇对 ICaL 有阻断作用 , 主要作用于钙通道激活和恢复过程 .【关键词】白藜芦醇；全细胞膜片钳；钙电流0 引言白藜芦醇化学名为3,5,4 三羟基反二苯代乙烯 (3,5,4 trihydroxyransstilbene) ，是一种主要存在于葡萄皮、花生中的多酚类植物抗毒素 . 现认为它是适量饮用葡萄酒有利于心血管健康的主要作用因子 1. 大量研究 2-3 发现白藜芦醇对心肌缺血再灌注损伤有保护作用； 对血管有广泛的舒张效应 4;能抗动脉粥样硬化，防治冠心病 5. 但其对心肌细胞离子通道的作用少见报道，我们采用膜片钳技术研究白藜芦醇对心室肌细胞 ICaL 的影响 .1 材料和

7、方法材料健康成年豚鼠 31 只（武汉大学医学院动物中心） ，体质量 250350 g，雌雄不拘； I 型胶原酶，蛋白酶 E,HEPES（Gibco 公司）； CSOH, CSCl, Na2ATP（ Sigma公司）；白藜芦醇（西安赛得高科生物股份有限公司） ；其余均为国产分析纯 . 无钙台氏液 (mmol/L) ：NaCl 135，KCl ，MgCl2 1，NaH2PO4，Glucose 20，HEPES 10， pH (NaOH 调节 );KB 液(mmol/L) ： glumatic acid 50 ， KOH 85， KCl 30，MgSO4 3，Taurine 20 ， Glucose

8、 10 ， HEPES 10，EGTA， pH (KOH调节 ) ；电极外液组成 (mmol/L) ：NaCl 37，Choline Chloride 100，CaCl2 ，MgCl2 ，HEPES 10，Glucose 10， CSCl ，pH (CSOH调节 ) ；电极内液组成 (mmol/L): CSCl 120，CaCl2 ， MgCl2 5 ， Na2ATP 5，EGTA 11， HEPES 10，Glucose 11 ，pH (CSOH 调节). 白藜芦醇在 DMSO中配成 mmol/L 母液，每次实验时 , 母液溶于电极外液中配成实验所需终浓度进行灌流 ,DMSO终浓度低于 1

9、mL/L.方法心室肌细胞的分离将豚鼠腹腔注射肝素 500 U/kg ，头部击昏 , 迅速开胸取出心脏置于 1000 mL/L O2 饱和的 4生理盐水中冲洗，剪开心包，连接于 Langendorff 心脏灌流装置上逆行灌流，灌流压维持在 70 mm H2O，用无钙台氏液灌流 3 5 min ，冲出心脏内残留血液，心脏完全停跳后，改用含 mg/L 型胶原酶， mg/L 蛋白酶 E 的低钙液（ Ca2+ 80 mmol/L）灌流 35 min, 至心脏膨大松弛流出液成丝后取下， 除去心房，在含 BSA1 g/L 的 KB液中剪碎心室肌， 37温孵，稀释，倒出上清液 , 此为第一份细胞贮存液 . 剩

10、余的沉淀部分继续用 KB 液温孵，稀释，倒出上清依次可以得到多份细胞存储液 . 灌流液始终给予 1000 mL/L O2 饱和 , 循环水浴使灌流液保温在 37左右 .全细胞记录技术吸数滴细胞保存液加于mL 灌流槽，置于倒置显微镜（ Olympus IX70）载物台上，待细胞静置贴壁，细胞外液灌流清洗细胞，电极选用硬质玻璃 ( 上海神经生理所提供 ), 经微电极拉制 (Narishige PB7) 二次拉制而成 , 电极充以内液后阻抗 5 M . 选取横纹清晰，表面无颗粒，无收缩的细胞，采用微电极操纵仪 (Narishige MD320) 移动电极，当电极尖端与细胞表面形成高阻抗封接后（ 2

11、G ）, 补偿电极与细胞膜之间的电容 , 进一步给负压吸破细胞膜 , 经电容电流和电极串联补偿即可行全细胞记录 . 所有实验均在室温下进行 . 试验分组共分为 4 个浓度组 , 分别为对照组（ n=8）,1 mol/L （n=9） ,50 mol/L （n=7） ,100 mol/L （ n=7），记录药物灌流前后 ICaL ，50 mol/L组还需记录通道激活，失活和失活后恢复电流.统计学处理：数据分析采用 pulse 软件对全细胞记录进行图形与数据转换，数据以 x±s表示，origin 软件对数据进行统计学处理， 并进行曲线拟合 . 不同浓度药物作用前后间比较采用 OnewayA

12、NOVA检验及 LSDt，50 mol/L 白藜芦醇作用后通道动力学改变采用 t 检验， P<为有统计学差异 .2 结果对 ICaL 浓度依赖性阻断作用采用保持电位-40 mV,指令电压 -40 60 mV,钳制时间 200 ms，阶跃 10 mV的刺激程序引出 ICaL，并且记录 30 min 内“ rundown” 现象（ n=7），得出在 12 min 内衰减明显，所有的电流记录均在电流稳定后进行 . 灌流给药 5 min 后药效稳定 . 结果显示白藜芦醇（ 1100 mol/L ）对 ICaL 呈浓度依赖性阻断作用， 0,1,50,100 mol/L 作用时 ICaL 峰值分别为

13、（±），（±），（±） , （± ）nA (F=,P=; 多重比较后，任两组间 P=，图 1）. 白藜芦醇作用后洗脱， ICaL 大部分恢复（图 2） .a ：给药前 ;b：1 mol/L 白藜芦醇 ; c ：50 mol/L 白藜芦醇 ;d：100 mol/L 白藜芦醇 .图 1 不同浓度白藜芦醇对 ICaL 的影响（略）a：给药前 ;b：50 mol/L 白藜芦醇 ;c ：洗脱后 .图 2 白藜芦醇作用及洗脱后对 ICaL 的影响（略）对电流电压曲线的影响从保持电位 -40 V 逐步去极化至 +60 V, 阶跃为10 V, 持续时间 200 ms.

14、50 mol/L 藜芦醇作用后，对钙电流的最大激活电位和反转电位均无影响，但使最大峰值电流降低（±）（ n=5，P，图 3）.图 350 mol/L 白藜芦醇对 ICaL 的 IV 曲线的影响（略）对稳态激活动力学曲线的影响根据上述脉冲刺激得到的电流值, 按Boltzmann 方程进行拟合 :G/Gmax=1/1+exp(V V1/2/ ) . (G 为电导 ,V1/2 为曲线中点的电压 , 为曲线的斜率 ). 给予 50 mol/L 白藜芦醇前后， V1/2/ 分别为（ - ±），（±） V（n=7， P=）, 分别为±，±（ n=7， P=

15、）. 白藜芦醇能使激活曲线明显右移（图4）.图 4 白藜芦醇对 ICaL 激活曲线的影响（略）对稳态失活动力学曲线的影响采用双脉冲刺激法，保持电位为-60 V, 开始逐步去极化至 +30 V, 阶跃 10 V, 持续 1 ；在每次条件脉冲后都紧跟一个固定的去极化至 10 V, 持续 300 的脉冲 , 然后回到 -60 . 将记录到的 ICaL 值经 Boltzmann 方程拟合 I/Imax=1/ 1+exp(V-V1/2/ ) . 50 mol/L白藜芦醇作用前后， V1/2/ 分别为（±），（±） V（n=8，P=）, 分别为±，±（ n=8，P=

16、）. 因而白藜芦醇对 ICaL 稳态失活曲线无影响（图 5）.图 5 白藜芦醇对 ICaL 失活曲线的影响（略）对失活后恢复动力学曲线的作用采用双脉冲刺激法 . 保持电位为 -60 ,给予去极化至 10 的刺激 , 持续 250 , 回到保持电位持续 50 后 , 再给予同样刺激 , 前后两个脉冲的间隔时间逐渐增加 , 每次增加 50 s, 共 9 次脉冲 . 加药前得到的曲线可以用单指数方程拟合 . 给药前后的时间常数 （）为（±），（±） ms( n=6，P=，图 6）.图 6 白藜芦醇对 ICaL 失活后恢复曲线的影响（略）3 讨论ICaL 在心肌细胞电活动中起重要作

17、用 . 它是维持一个较长平台期的主要内向电流，为其他离子流的活动提供合适的电位条件 . 钙通道阻滞剂不仅可以减少细胞内钙离子浓度， 减少钙超载的发生， 减少降解酶类的激活释放而引起的的心肌缺血再灌注损伤；还可以缩短 APD，减少兴奋性折返引起的早后去极化，减少心律失常的发生 .白藜芦醇的研究最早始于“法国悖论”现象，即法国人喝大量葡萄酒，血液中饱和脂肪酸几乎是其他发达国家的四倍， 但是罹患心脏病的危险确只是后者的三分之一 6. 研究表明这种现象与葡萄酒中的一种称为白藜芦醇的物质有着密切关系，它可以减少心肌缺血再灌注损伤、 舒张血管、抗动脉粥样硬化等 . 白藜芦醇作为钙通道阻断剂减少胞内钙超载的

18、特点进一步揭示其发挥心肌保护作用的机制 . Pakaki 等 7研究发现预先给予大鼠不同剂量的白藜芦醇进行干预，可以不同程度的减少心肌缺血再灌注后室早室颤的发生率 . 本试验可以进一步解释此研究结果， 白藜芦醇作为钙通道阻断剂可以减少兴奋折返， 减少心律失常的发生 .本实验不足之处是仅就正常心室肌细胞的钙通道进行研究，对于病理状态如缺血缺氧，以及其他通道如钠，钾，氯通道及其各种亚型，和细胞膜上的各种离子泵的作用还有待进一步研究 .【参考文献】1 Wu JM, WangZR, Hsieh TC, et al.Mechanism of cardioprotectionby resvertrol,a

19、 phenolicantioxidantpresentin red wine J. IntJ MolMed, 20XX, 8(1): 3-17.2 Hung LM, Chen JK, Huang SS, et effectof resvertrol,anaturalantioxidantderivedfrom grapesJ. Cardiovasc Res, 20XX, 47(3):549-555. 3 陈莉娜 , 臧伟进 , 唐玉海 . 白藜芦醇心血管保护作用研究进展 J. 生理科学进展 ,20XX,34(3):272-274.4 ElMowafy AM. Resvertrol activates membranebround guanylyl cyclase in coronary arterial smooth muscle: A nov