电刺激对胰岛素抵抗的C2C12肌管糖转运能力的影响

1、    电刺激对胰岛素抵抗的c2c12肌管糖转运能力的影响    贾章志 徐晓阳 赵秀峰摘 要：目的 刺激胰岛素抵抗状态的c2c12肌管产生收缩，观察收缩对其糖代谢的影响。方法 将胰岛素抵抗状态的c2c12肌管分为c组、e组、p组、p+e组。c组和e组用2%bsa无酚红高糖dmem孵育，p组和p+e组用浓度0.5 mmol/lpa培养液孵育16h。以15v，30ms，2hz的强度电刺激e组和p+e组60min，测定细胞培养液葡萄糖剩余量、总蛋白量、glut4细胞膜蛋白量、ampk-2mrna表达量。结果 （1）p组培养液葡萄糖剩余量明显高于c组，e组培养

2、液葡萄糖剩余量明显低于c组，p+e组培养液葡萄糖剩余量略高于c组，与p组相比明显下降。各组细胞培养液ldh活性均无显著性差异。（2）与c组相比，p组ampk-2基因表达显著下降，e组明显升高，60min电刺激后，p+e组ampk-2基因表达较p组明显提高。（3）p组肌管细胞膜glut4蛋白量、总蛋白量比c组减少。e组肌管细胞膜glut4蛋白量上升，总蛋白量变化不明显。与p组相比，p+e组肌管细胞膜glut4蛋白量升高，总蛋白无显著变化。结论 15v，30ms，2hz电刺激棕榈酸诱导的胰岛素抵抗c2c12肌管60min可以改善胰岛素抵抗的状态。关键词：c2c12 棕榈酸 胰岛素抵抗 电刺激 am

3、pk-2 glut4：g80-32 ：a ：2095-2813（2018）06（b）-0018-02电刺激是采用特定频率、波形和强度的脉冲电流来刺激骨骼肌收缩产生运动，主要用于疲劳的恢复、运动损伤的治疗、增加肌肉力量等方面。国外研究发现电刺激肌管能迅速改变骨骼肌细胞的基因表达，这些特征都与活体肌肉收缩变化类似。本研究利用电刺激体外培养的肌管收缩，探究收缩对胰岛素抵抗肌管的作用。1 研究材料与方法1.1 研究材料小鼠骨骼肌肌母细胞株（c2c12细胞）购买于由南方医科大学。1.2 实验方案利用本实验室前期建立的pa诱导的c2c12胰岛素抵抗模型，做电刺激对胰岛素抵抗机制的研究，将肌管饥饿处理12h

4、后分为c组、e组、p组、p+e组。c组和e组用2%bsa无酚红高糖dmem孵育，p组和p+e组用浓度0.5mmol/lpa培养液孵育16h，换电刺激液（4ml），以15v，30ms，2hz的强度电刺激e组和p+e组60min，各组同时收样，比色法比较c2c12肌管培养液乳酸脱氢酶（ldh）活性，葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测c2c12肌管培养液葡萄糖剩余量，western blot方法测定glut4表达，rt-pcr测试肌管中ampk-2mrna的表达。1.3 数据统计处理利用spss 19.0软件进行数据处理，用平均值±标准差的方式表示数据。各组数据间差异的显著性用单因素方差分析检

5、验，p<0.05即具有显著性差异，p<0.01具有极显著性差异。2 研究结果2.1 不同干预后c2c12肌管培养液糖剩余量、ldh活性的变化电刺激60min后，e组肌管培养液中葡萄糖剩余量明显低于c组（p<0.05），p组培养液中的葡萄糖剩余量明显高于c组（p<0.05），p+e组培养液的葡萄糖剩余量明显低于p组（p0.05）。2.2 不同干预后c2c12肌管ampk-2 mrna含量的变化p组与c组相比ampk-2基因表达显著下降（p<0.05），e组比c组显著升高（p<0.05）。电刺激后，p+e组ampk-2基因表达相对p组明显上升（p<0.05

6、）。2.3 不同干预后c2c12肌管glut4蛋白表达p组肌管细胞膜glut4蛋白量比c组低29.14%（p<0.01），总蛋白低25.42%（p<0.01）。e组细胞膜glut4蛋白量比c组高6.5%（p0.05）。与p组相比，p+e组肌管细胞膜glut4蛋白量高22.62%（p0.05）。3 分析与讨论3.1 电刺激强度的确定本研究使用强度为15v，30ms，2hz电刺激后，各组ldh活性值各组间无显著性差异（p>0.05），e组培养液中葡萄糖剩余量明显低于c组（p<0.05），p+e组培养液中葡萄糖剩余量明显低于p组（p<0.05）。说明本研究所选用的电刺激

7、强度并没有造成肌管的大量损伤和死亡，同时促进了肌管对于葡萄糖的吸收和代谢。3.2 电刺激对pa诱导的胰岛素抵抗c2c12肌管糖代谢的影响研究发现处于胰岛素抵抗状态下的大鼠骨骼肌细胞glut4mrna和蛋白表达都具有缺陷1，影响大鼠对糖的摄取和利用，运动可以改善大鼠的胰岛素抵抗。对分化5天的c2c12肌管进行电刺激60min后，培养液中的葡萄糖剩余量与c组相比显著下降（p<0.05），电刺激引起的收缩可以有效地促进肌管对糖的吸收和利用。pa孵育后，肌管培养液中葡萄糖的剩余量高于c组（p<0.05），这说明pa损害了肌管糖吸收和代谢功能。而p+e组肌管的葡萄糖剩余量明显低于p组（p&l

8、t;0.05），说明电刺激引起的收缩可以改善由pa带来的胰岛素抵抗。3.3 电刺激对pa诱导的胰岛素抵抗c2c12肌管ampk-2 mrna表达的影响60min的电刺激可以引起ampk-2表达的上升（p<0.05），与本实验室前期的研究结论一致。p组相对于c组，ampk-2表达明显下降（p<0.05）。与p组相比，p+e组ampk-2表达得到改善（p<0.05）。在pa诱导产生的胰岛素抵抗状态下，ampk-2的表达受到严重损害，而适当的电刺激则可以改善由于胰岛素抵抗造成的ampk-2表达下降的结果。我们推测收缩可以通过激活ampk-2基因的表达，提高glut4的转位和表达，促

9、进骨骼肌對葡萄糖的吸收和利用。3.4 电刺激对pa诱导的胰岛素抵抗c2c12肌管glut4蛋白表达和转位的影响当机体处于胰岛素抵抗或2型糖尿病状态时，骨骼肌中glut4mrna和glut4蛋白表达明显低于正常大鼠1。通过电刺激肌管，发现ampk-2基因表达上升，同时glut4蛋白转位明显增加（p<0.05），总蛋白量也有所上升，与本实验室的前期研究和大多数学者的研究是吻合的。我们可以推测，适宜的电刺激可以通过激活ampk-2基因的表达，促进glut4的转位和表达，改善细胞摄取葡萄糖的能力。与c组相比，p组glut4膜蛋白量和总蛋白量都明显下降（p<0.01），这说明在pa诱导的胰岛素抵抗状态下，c2c12肌管glut4蛋白转位和表达明显下降，严重影响了肌管糖摄取的能力。p+e组与p组相比，glut4的膜蛋白量明显上升（p0.05）。这说明处于胰岛素抵抗状态的肌管经电刺激引起其收缩后，ampk-2基因表达上升，glut4的转位和表达得到改善，电刺激引起的收缩可以通过激活ampk-2基因的表达，促进gl