最新支原体污染-细胞培养技术精品课件教学教材

1、支原体污染-细胞培养技术2支原体污染易被忽视支原体污染易被忽视1.培养液可不发生混浊2.细胞病理变化轻微或不显著3.细微变化也可由于传代，换液而缓解。4.个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落6支原体污染的来源支原体污染的来源 操作者无菌操作技术不当、 污染之培养基、血清、细胞等。 操作室环境不佳、实验器具不洁。7科研人员的困惑科研人员的困惑有些实验结果仅能在支原体阳性的细胞中得到也曾有利用肿瘤细胞制备的单克隆抗体实为针对所污染的支原体的抗体。还有的科研成果,他人无法重复,也因所用细胞有支原体污染所致。实验结果真实性和可靠性大大下降8支原体污染对细胞的影响支原体污染对细胞的影响 1、

2、影响细胞的生长状态及形态 支原体可使培液中支持细胞生长的营养物质含量减少，造成细胞生长缓慢甚至停止；另外还会导致细胞微管解聚，引起细胞一系列病变，表现为细胞收缩、贴壁细胞脱落、裂解等。9支原体污染对细胞的影响支原体污染对细胞的影响10支原体污染对细胞的影响支原体污染对细胞的影响2.影响细胞的代谢和功能 （1）培液中的精氨酸被支原体大量消耗，引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合成障碍； （2）支原体活动使培液成分发生改变（如发酵型支原体降解糖类产生酸性物质），影响细胞代谢。 （3）支原体吸附在细胞表面，破坏细胞膜的完整性，影响细胞信号传递；11支原体污染对细胞的影响支原体污染对细胞的影

3、响 （4）支原体消耗细胞的核苷库染色体异常1213支原体污染对细胞的影响支原体污染对细胞的影响 3、其他 此外，支原体污染还会影响一些病毒在细胞中的产量、使恶性细胞致癌能力下降、影响淋巴细胞分化等。14支原体污染的检测方法支原体污染的检测方法 培养法 DNA荧光染色法 聚合酶链反应(PCR)法 电子显微镜法 相差显微镜检测 3-H胸腺嘧啶掺入法 酶联免疫吸附试验、免疫荧光法 低张处理地衣红染色观察15支原体污染的常用检测方法支原体污染的常用检测方法 1.培养法：原理是利用营养丰富的培养基,直接对待检细胞、血清等进行支原体培养。支原体集落呈支原体集落呈“油煎蛋油煎蛋”样样缺点：灵敏度低，试验周期

4、长，不能检测到种且不适用于检测所有支原体。16支原体污染的常用检测方法支原体污染的常用检测方法 DNA荧光染色法 利用荧光Hoechst33258标记细胞和支原体DNA,在紫外光(波长为630 nm)激发下产生黄绿色荧光,利用荧光显微镜观察支原体是否存在。17支原体污染的常用检测方法支原体污染的常用检测方法 缺点：有时易出现假阴性和假阳性18支原体污染的常用检测方法支原体污染的常用检测方法 PCR法：通过扩增被检测标本中的支原体DNA ,再进行琼脂糖凝胶电泳。电泳完毕,将电泳胶在紫外投射仪下观察,根据标准分子量及阳性对照、内对照条带,观察待测样品中是否有阳性条带。19应对支原体污染的策略一应对

5、支原体污染的策略一 细胞一旦发生了支原体污染,应当弃之。虽然已有了针对支原体的抗生素及最近出现的所谓支原体清除剂,这些方法只能杀灭细胞外的支原体。 除非是不可替代或无法重新获得的细胞一，般没有必要进行支原体清除工作。20支原体的清除方法支原体的清除方法21支原体的清除方法支原体的清除方法 新一代支原体抗生素M-Plasmocin 其含有两种杀菌成分,一种成分通过干扰核糖体的翻译功能而使蛋白合成受阻。另一种成分则通过干扰复制叉的形成而阻止DNA的复制。 可以强效对抗支原体及相关的无胞壁的细菌,同时又不影响细胞本身的代谢,且处理过的细胞不会重新感染支原体,是目前对抗支原体最理想的方法。22M-Plasmocin支原体感染的细胞支原体感染的细胞经经M-Plasmocin处处理过的细胞理过的细胞23应对支原体污染的策略二应对支原体污染的策略二1.从可靠来源引进、使用细胞,特别是知名的信誉良好的专门机构,如ATCC、基础医学细胞中心等,这些机构对细胞质量进行一系列检测。2.预防为主:细胞培养实验室应制定严格的管理制度,按照规范的实验程序