山大生化实验报告实验一、三酵母RNA的提取和含量测定

1、酵母rna的提取和含量测定姓名：周超 学号：201100140067 班级：11级生命基地 同组者：刘炳煜 时间：2011年3月26 fl【实验目的】1. 掌握稀间法提取酵母rxa的原理和方法2. 了解测量核算浓度的不同方法的原理3. 掌握紫外吸收法测定核酸浓度的原理和技术4. 学会使用紫外分光光度计5. 学会使用离心机【实验原理】1. 酵母rna提取的原理：(1) 酵母核酸屮rna含量较多，dna则少与2%(2) rna可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加入乙醇使其沉淀，由此可制 得粗rna制品。(3) 用碱提取的rna有不同程度的降解。2. 紫外吸收法测rna含量的原理：(1) 核酸具冇吸收

2、紫外线的性质，在波长260nm处有最大吸收，且在一定浓 度范围内光吸收值与浓度成止比(5-45ug/ml),符合朗伯比尔定律。(2) 优点：操作简单，样品用量少，不用显色，测完后样品可以继续使用。(3) 缺点：当有大分子物质存在吋，也会有一定的吸收，会影响测量精确度。【实验试剂】1. 提取试剂：0. 2% naoh溶液酸性乙醇：5ml浓hc1加入到500ml95%乙醇中混匀95%乙醇无水乙醇2. 含量测定试剂：0. 2% naoii溶液ph 试纸(1-14) 标准核酸：200ug/ml 待测样品核酸【实验步骤】(1) 将4g干酵母粉放入200ml锥形瓶中,加入40ml 0.2%的naoh溶液混

3、匀。(2) 沸水浴30min,然后用流水冷却(3) 4000转/分离心15秒，保留上清液(4) 在上清液中加入40ml酸性乙醇，边加边搅拌，静置5分钟左右，再4000 转/分离心5分钟，保留沉淀(5) 用20ml 95%乙醇分两次洗涤沉淀，每次洗后3000转/分离心5分钟(6) 用20ml无水乙醇分两次洗涤，每次洗后3000转/分离心5分钟(7) 收集沉淀于滤纸上备用。2. rna含量的测定：(1) 准确称取0. 2-0. 25g (因提取到的rna粗品量太少，本次实验使用的r7a 量仅为0. 1910g)样品核酸,加2ml 0. 2% naoh溶液和lml水溶解，调成 糊状(2) 再加入50

4、ml左右的水溶解，边溶解边传移到100ml烧杯屮，用0. 2%naoh 调至中性，定容至100ml(3) 再分3次取2. 5n)l定容至100ml备用，做平行实验(4) 取200ug/ml的标准rxa 20ml,加水定容至100ml,得到40ug/ml的rna 备用(5) 再将 40ug/ml 的 rna 按表一加样稀释，得到 5ug/ml> 10 ug/ml> 20 ug/ml> 30 ug/ml> 40 ug/ml的标准溶液(6) 用紫外分光光度计测量吸光值，绘制标准曲线，计算样品纯度。【实验结果】表一管号标准曲线样品012345678标准rna (40ug/ml)

5、 /ml02.55101520/水/ml2017.5151050/标准rna浓度/ (ug/ml)0510203040/01)值00. 0970. 1910. 3830. 6210. 7670. 6380. 6480. 638图一标准曲线标准曲线y = 0.0196x计算：三次平行实验平均0d值=0. 6413,根据标准曲线，得到稀释后的rna浓度为32. 719ug/ml,则样品 rna 的纯度为(32. 719*40*100) / (0. 1910*10”) =0. 6852【思考讨论】实验结果分析：本次实验最终的测定结杲为，rna的纯度为6& 52%,造成这个结杲的原因：(1)

6、用稀碱法提取的rna有不同程度的降解(2) 人在操作过程屮，会呼出少量的ra酶，也会降解样品rna,导致纯 度下降。(3) 提取的样品屮冇细胞内含物，也会对纯度冇影响。注意事项：(1) 离心机使用的注意事项：离心时，离心管要平衡对称放置，既耍位置对称, 又要重量平衡。否则会造成离心机损坏。(2) 提取ra吋，用酒精沉淀吋，一定要充分，边加酒精边搅拌上清液。(3) 提取rxa时，用酒精洗涤沉淀时，一定要把酒精与沉淀混匀，这样做有利 丁增高捉取浓度。(4) rna含量测定中，若rna样品少与2.0g时，取2. 5ml的母液，定容至100ml； 若rm样品量为2. 0-2. 5g,则取2. 0ml的母液，定容至100ml,这样稀释之后, 可以保证测量液的吸光值在