薛垂召本科毕业设计

1、香鳞毛蕨提取物抑菌活性的研究1前言11香鳞毛蕨的种属及形态特征香鳞毛蕨 Dryopteris fragrans 属种： Dryopteris fragrans 属名： 鳞毛蕨属 Dryopteris 科名： 鳞毛蕨科 Dryopteridaceae 属种名定名： Dryopteris fragrans (L.) Schott 植株高20-30厘米。根状茎短粗直立或稍斜升。叶簇生，具柄，叶柄显著短于叶片，常为叶片长度的1/4-1/6，连同叶轴、羽轴密被红棕色至棕褐色鳞片；鳞片广卵形(上部缩成颈状)至卵状披针形，膜质，基部心形，先端尾状渐尖，边缘具短尖齿；叶片长圆状披针形至倒披针形，长10-24厘

2、米，宽2.8-5厘米，基部略狭缩，先端渐尖，2回羽状全裂，羽片通常20对以上，互生或近对生，几乎无柄，披针形至广披针形，尖头；裂片狭长圆形，钝头，具细锯齿。孢子囊群圆形，背生于小脉上，沿裂片中脉排成2行，囊群盖盾状或圆肾形，具一深缺刻，幼时完全覆盖孢子囊群，膜质，灰褐色，边缘多少有不规则缺刻，具淡黄色腺体；孢子椭圆形，表面有瘤状突起。 12香鳞毛蕨的生活环境香鳞毛蕨仅存在火山熔岩形成的岩石凹陷处或空隙中，土壤层均为熔岩上发育的原始土。N、P、K、有机质含量丰富，呈酸性土壤，PH值4.715.21。其中五大连池和镜泊湖地区是香鳞毛蕨生长的最适环境。13香鳞毛蕨的分布及研究前景香鳞毛蕨Dryopt

3、eris fragrans (L)Schott生长于海拔10001700m的山坡或岩石缝中，分布于我国东北、华北、华中，俄罗斯(远东地区)、朝鲜、日本及北美洲一些国家也有分布。目前中草药的研究已成为药学研究的热点之一,一些中草药具有抗菌、消炎、不易产生耐药性、无毒或低毒、无残留或低残留等特点1,备受青睐。我国民间验方利用香鳞毛蕨已有几十年的历史，证明香鳞毛蕨对多种皮肤病均有较好的治疗效果。通过多年的人体试验，发现香鳞毛蕨对老年性皮肤瘙痒、青少年的痤疮、扁平疣的治疗效果极其显著，具有极大的开发潜力和应用前景。本实验研究香鳞毛蕨的抑制细菌作用。目前，在我国的药品市场及化妆品市场中，治疗皮肤病的药剂

4、很多，但真正为纯天然的中草药却很少。特别是困扰青少年的痤疮，治疗效果均不显著。在五大连池地区，在民间利用香鳞毛蕨通过多年的人体试验，已具有稳定可靠的治疗效果，加之香鳞毛蕨属于纯天然药物，无副作用，深受人们的喜欢。所以系统、科学地对香鳞毛蕨的药用价值进行研究是非常紧迫的，筛选抑菌活性强的中草药,为临床用药、开发中草药制剂提供依据。这对于保护香鳞毛蕨资源和开发具有重要的意义。14香鳞毛蕨的研究现状香鳞毛蕨如能作为一种新药应用,对北药开发具有重大现实意义。141化学成分研究香鳞毛获中主要含有三类化学成分：间苯三酚类、惦类、黄酮类。迄今为止，日本学者在其正己烷提取物中分离得到的单体成分有：Aspidi

5、nAB(绵马素AB)、AspidinBB(绵马素BB)、AspidinPB(绵马素PB)、Aspidinol(绵马酚)、Cadinene(-杜松烯)、Diyofragin(香鳞毛蕨素)Sitosterol(-谷甾醇)等。这些均属脂溶性成分， 目前为止，其水溶性成分尚未见报道。国内有学者也正在对其化学成分做更深入的研究，相信不久会有更多新的单体成分被发现。142对真菌的抑制作用沈志滨等人对香鳞毛蔗进行了抑菌作用的实验研究。香鳞毛蕨的提取液：采用煎煮法的水提液、醇提液(分别采用25%、50%、70%、90%乙醇提取)、采用回流法的醚提液，制得提取样品（水提取液）、（25%醇提取液）、（50%醇提取

6、液）、（70%醇提取液）、（95%醇提取液）、（醚提取液）,各提取液均含生药1g/ml。达克宁的甲醇提取液做对照使用琼脂扩散法考察其对红色毛癣菌、石膏样毛癣菌、大小抱子菌、絮状表皮癣菌、许兰氏毛癣菌、断发毛癣菌的抑菌效果,结果表明6种提取液中醇提取液的抑菌效果最好，水提液较弱，醚提液最弱，证明香鳞毛蔗的醇提液对真菌具有较好的抑制作用。143制剂的药效学研究民间流传香鳞毛蔗对银屑病、头皮炎、干癣、痊疮等多种皮肤病有良好的治疗效果,香鳞毛旅还被一些居民视为“皮肤病克星”。144香鳞毛蔗擦剂1441对鼠尾鳞片表皮模型的影响罗容, 金哲雄进行的相关实验研究,是利用鼠尾表皮缺乏颗粒层,与银屑病病理（增生

7、过快和分化不全）相似这一点来检验香鳞毛旅是否具有治疗银屑病的作用。实验采用的香鳞毛蕨擦剂由哈尔滨商业大学药学院研制,实验动物采用昆明种小鼠。阳性对照药是由市场上购得的牛皮癣软膏。实验发现香鳞毛蕨擦剂能促进鼠尾表皮层颗粒的的形成,从而证明了香鳞毛蕨对银屑病的治疗作用。1442对兔耳痊疮模型的影响使用三氯乙酸涂抹家兔耳内侧耳管创口建立痤疮模型，对给药组和对照组家兔进行肉眼观察。肉眼观察给药组家兔耳朵, 发现局部毛囊角栓减少部分角栓脱落后遗留点状凹陷的毛囊, 丘疹变平减少。肉眼观察空白组家兔耳朵,发现2周后耳部仍可见毛囊角栓, 但丘疹略减轻,变平。仅从肉眼观察的给药组与空白组结果的比较来看, 香鳞毛

8、蕨擦剂对座疮有一定的疗效。145香鳞毛蕨软膏剂对接种了石膏毛癣菌菌株并发病的大鼠用药,将药剂分别涂于各组大鼠染菌部位。用药九天后大鼠染菌部位皮屑明显减少, 红肿开始消退, 少数出现出血性红斑, 有的长出体毛, 十四天后各组大鼠染菌部位情况均有好转。经研究染菌大鼠病灶皮肤逆培养结果,得出香鳞毛蕨高剂量对大鼠试验性体癣有非常显著的治疗作用。2摘要21实验目的：一是摸索香鳞毛蕨的各种提取液提取条件的最优组合；二是对黑龙江省内的大、小兴安岭和东部山区的主要代表地区生长的香鳞毛蕨不同月份的抑菌效果的比较22实验方法：1、利用正交法对香鳞毛蕨的各种提取液提取条件进行优化；2、抑菌效果的比较是采用的药敏纸片

9、（抑菌圈）法进行的。3、通过其抑菌效果的比较，作为香鳞毛蕨地点、时间抑菌效果临床研究的基础参考。23实验结果：本研究对香鳞毛蕨抑菌物质的提取工艺进行了研究，试验结果表明超声波提取法，提取时间5min，提取温度60，乙醇浓度50%为最佳提取方法。并且结果发现黑龙江省内的大、小兴安岭和东部山区的主要代表地区生长的香鳞毛蕨均具有较好的抑菌作用，其中以五大连池地区抑菌作用最好。并确定67月为香鳞毛蕨的最佳采收时期。24展望香鳞毛蕨对各种皮肤病的治疗效果得到确定, 将会有广大的发展前景, 本文中各种对香鳞毛蕨的研究,都为香鳞毛蕨的开发和利用打下了坚实的基础。2试验材料和仪器2.1试验材料采自五大连池、镜

10、泊湖、呼中林业局、伊春红星湿地等不同地区的香鳞毛蕨植株，阴干备用。五大连池地区45月，67月，8 月，910月、1112月不同采收期的香鳞毛蕨植株数株阴干备用。分离香鳞毛蕨不同采集部位根茎、叶、叶柄、鳞毛碎片，碎片备用。香鳞毛蕨植株由中科院植物研究所张宪春教授鉴定。供试细菌：大肠杆菌（Escherichia coil）枯草芽孢杆菌（Bacillus subfilis）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（购自黑龙江微生物研究所）牛肉膏蛋白胨培养基（细菌用）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、食盐5g、琼脂18g、水1000ml、pH7.27.42.2试验仪器DS-101S恒温水

11、浴锅 郑州长城科工贸有限公司RE-52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂DHG-9623A型恒温培养箱 上海精宏试验设备有限公司2022A电热干燥箱 北京光明医疗仪器厂LS-S11全自动立式电热压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂超净工作台 上海博讯实业有限公司医疗设备厂3试验方法3.1香鳞毛蕨提取物的制备根据沈志滨（2005年）的香鳞毛蕨生药学的研究和对香鳞毛蕨提取液进行的初步抑菌试验结果，我们分别采用水提液，醇提液常规浸泡法、超声提取法提取香鳞毛蕨提取液（在超声波提取法中进行提取方法的优化设计），并探讨对几种细菌的抑制作用。3.1.1香鳞毛蕨水提取液制备将阴干的香鳞毛蕨植株用冻干机

12、干燥后，用组织粉碎机粉碎，以1：10的料液比（即称取样品2g置砂锅中，加蒸馏水 20ml）浸泡 4h 后，用文火煮 30min，过滤，离得上清液，水提液经微孔滤膜（0.22m）除菌后备用。3.1.2香鳞毛蕨醇提取液常规浸泡法将阴干的香鳞毛蕨植株用冻干机干燥后，用组织粉碎机粉碎，以1：10的料液比【即称取样品2g置砂锅中，加75%（V/V）乙醇 20ml】浸泡 4h 后，用文火煮 30min，过滤，离得上清液，（过滤液已不含乙醇或乙醇很少），醇提液经微孔滤膜（0.22m）除菌后备用。3.1.3香鳞毛蕨超声波过滤提取法提取剂有：蒸馏水、25%（V/V）乙醇、50%（V/V）乙醇、75%（V/V）乙

13、醇、90%（V/V）乙醇。将阴干的香鳞毛蕨植株用冻干机干燥后，用组织粉碎机粉碎，配以料液比为1：10的（即称取样品2g置砂锅中，加提取剂 20ml）混浊液，分别在30、45、60、75的恒温水浴条件中超声波浸提 5min、10min、15min、20min后，用文火煮 30min，过滤，离得上清液，各提液经微孔滤膜（0.22m）除菌后备用。3.1.4香鳞毛蕨提取液超声波抽滤提取法取样品2g于100mL三角烧瓶中，加入75%乙醇后（料液比为1：10）在一定条件下超声浸提，所得到的浸提液趁热真空抽滤，醇提液经微孔滤膜（0.22m）除菌后备用。3.2阳性对照和阴性对照3.2.1阴性对照50%乙醇3.

14、2.2阳性对照硫酸庆大霉素溶液对于硫酸庆大霉素溶液的浓度则是通过梯度法大致确定3.3离体试验抑菌活性测定3.3.1菌悬液的制备在超净工作台内，将上述供试菌用斜面活化后，活化菌种接种于灭菌后装有液体培养液的小三角瓶中摇床培养28培养12h，4放置备用或马上接种使用。将滤纸用打孔器制成直径10mm的小圆片，干热灭菌后放入石榴皮醇提液中浸泡1h，取出晾干（挥发掉酒精）。在超净工作台上将灭菌后的培养基倒入无菌平皿中，每皿约15ml，取各种供试菌悬液0.1ml于相应平皿上用L棒将菌液涂布均匀，用无菌镊子夹取晾干的滤纸片贴在含菌培养基表面，以浸有乙醇并晾干的滤纸片作为对照，每皿5片。将贴好滤纸片的含菌培养

15、基置恒温培养箱中培养，细菌在37下培养24h培养好后取出测定抑菌圈直径。3.4 硫酸庆大霉素溶液的浓度确定3.4.1方法首先配制0.5g/ml、0.1g/ml、0.02g/ml、0.01g/ml、0.004g/ml梯度的硫酸庆大霉素溶液其次分别用上述浓度的硫酸庆大霉素溶液浸泡过的滤纸片贴到刚涂有菌液的平板上最后29下过夜培养，测其抑菌圈3.4.2结果庆大霉素浓度（g/ml）0.50.10.020.010.004枯草芽孢杆菌抑菌圈（mm）43*3535+323130292828242424金黄色葡萄球菌抑菌圈（mm）35*3030+212120171616注：*表示抑菌圈很大，但边界模糊。表示无

16、抑菌圈或抑菌圈很小（不大于13mm）资料显示浓度在0.01g/ml与0.004g/ml之间较与提取液抑菌效果相近，故取0.007g/ml。3.5香鳞毛蕨提取方法的优化设计根据142，选择抑菌效果好的乙醇为提取溶剂，采用超声提取方法，以枯草芽孢杆菌为指示菌，采用滤纸片法考察乙醇浓度、提取温度、提取时间对提取物抑菌效果的影响。采用L9(34)正交表，以乙醇浓度、提取温度、提取时间3个因素，选择3个水平进行正交试验，因素水平表见表3-5。以指示菌枯草芽孢杆菌为研究对象，以实验抑菌圈直径的平均值的为指标评价提取液的抑菌效果。表3-5正交设计因素水平表Table 3-5 Factors and leve

17、ls of orthogonal experiment水平提取时间A (min)提取温度B()乙醇浓度C (%)1234510152030456075255075903.6数据分析试验数据为5次试验的平均值，记录为平均值±标准偏差。 数据间的差异性采用SPSS11.5 (SPSS for Windows, 1999, SPSS Inc., Chicago, IL)中的Pearson 相关分析。数据间差异显著则记录为 P<0.05。4结果4.1离体香鳞毛蕨提取液的抑菌效果表4-1不同提取方法提取液对供试菌的抑制效果Fig.4-1 Inhibition of different e

18、xtracts on some sorts of fungus提取方法 抑菌圈直径（mm）大肠杆菌（Escherichia coil）枯草芽孢杆菌（Bacillus subfilis）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）水提液醇提常规法醇提超声法75%乙醇+注：“”无抑菌圈，“+”表示有抑菌圈但不明显(仅小纸片没有长菌)。“+” “+”表示抑菌圈明显。由结果可见，醇提液效果明显好于水提液的抑菌效果。醇提超声法明显好于常规浸泡法。香鳞毛蕨水提取液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果不明显，70%乙醇对照组的抑制效果也不明显。且超声波提取方法简单、便捷、省时，

19、是香鳞毛蕨提取的最佳方法。结果也显示了香鳞毛蕨提取液对枯草芽孢杆菌的抑制效果好于金黄色葡萄球菌，对大肠杆菌的抑制效果最差。以下实验中均选取枯草芽孢杆菌作为指示菌。4.2提取工艺条件的优化采用L9(34)正交表，以乙醇浓度、提取温度、提取时间3个因素，选择3个水平进行正交试验，因素水平表见表3-5。以指示菌枯草芽孢杆菌为研究对象，以实验抑菌圈直径的平均值的为指标评价提取液的抑菌效果。表4-2 L9(34)正交试验结果Table4-2 Results of orthogonal experiment L9(34)试验号提取时间A (h)提取温度B()乙醇浓度C (%)抑菌圈直径平均值1234567

20、89101112131415161111222233334444123412341234123412342143341243211.381.921.61.491.61.71.821.581.51.731.751.561.361.582.681.61表4-4 极差分析表Table4-3 Results of The Range Analysisvar soursquare sumfree degreeaverage squareF valueTimerConceTempErrortotal0.019070750.227660750.128330750.06169150.43675375 3336

21、150.0063569170.0758869170.0427769170.0102819170.0291169170.6182618357.3806196964.160402973通过正交试验和极差分析可知，各因素对提取效果影响的大小顺序为B>C >A，即提取温度>乙醇浓度 >提取时间。根据F值大小发现，超声波法提取的不同超声温度效果影响最大。提取过程对时间相关性最小，不同时间对香鳞毛蕨提取液的提取效果几乎没有差异，因此时间确定为5min。 4.2.1提取温度对超声波提取抑菌物质的影响图4-1 提取温度对超声波提取抑菌物质的影响Fig. 4-1 Effect of ex

22、tracting temperature on the antifungal efficiency ofultrasonic extracts由图可见，提取温度在60时，提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径达最大，抑菌效果最好，但随着温度继续升高，抑菌效果反而降低；这可能是因为温度过高，在超声波作用下溶出的杂质增多，导致抑菌效果下降。较高的温度也可能使香鳞毛蕨中的有效成分失火，这也可能是在浸提方法和回流加热法中使用旋转蒸发仪导致温度过高而使药效降低的原因。所以确定最佳的提取温度为604.2.2乙醇浓度对超声波提取抑菌物质的影响由图可知，随着乙醇浓度的提高，抑菌圈增大，浓度在50%时，抑菌圈直径最大

23、，为2.36cm，抑菌效果最好。浓度继续增大时，抑菌圈反而减小，抑菌作用降低，这可能由于一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出增多，干扰因素随之增大，导致抑菌效果下降。图4-2 乙醇浓度对超声波提取抑菌物质的影响Fig. 4-2 Effect of ethanol concentration on the antifungal efficiency ofultrasonic extracts所以，最优提取条件当为提取时间5min，提取温度60，50%乙醇浓度4.3香鳞毛蕨不同采收地抑菌作用的比较表4-3 香鳞毛蕨不同采收地抑菌作用的比较 Table 4-5 Comparing of bact

24、eriostasis of different location地点12345平均值五大连池镜泊湖呼中伊春2.452.12.11.62.52.22.11.62.52.252.21.62.52.32.21.652.482.22.31.72.492.212.181.63采自五大连池、镜泊湖、呼中林业局、伊春红星湿地等不同地区的香鳞毛蕨完整植株使用超声波提取法制成香鳞毛蕨提取液，条件为提取时间5min，提取温度60，50%乙醇浓度。结果发现采自不同地区的香鳞毛蕨均有明显的抑制细菌作用，其中五大连池的抑菌效果最好可达2.49cm，其次是镜泊湖、呼中林业局、伊春红星湿地。图4-3 香鳞毛蕨不同采收地抑菌

25、作用的比较 Fig. 4-3 Comparing of bacteriostasis of different location4.4香鳞毛蕨不同采收期抑菌作用的比较表4-4香鳞毛蕨不同采收期抑菌作用的比较Table 4-4 Comparing of bacteriostasis of different harvest times采集时间12345平均值4-5月6-7月8月9-10月11-12月1.42.62.31.71.71.52.62.21.61.81.62.72.21.62.01.62.82.51.71.51.62.92.51.752.11.542.722.341.671.8图4-4

26、香鳞毛蕨不同采收期抑菌作用的比较Fig. 4-4 Comparing of bacteriostasis of different harvest times按照香鳞毛蕨在黑龙江的生长特点，采自五大连池地区45月，67月，8月、910月、1112月不同采收期的香鳞毛蕨植株使用超声波提取法制成香鳞毛蕨提取液，条件为提取时间5min，提取温度60，50%乙醇浓度。结果发现在67月的采收的香鳞毛蕨植株抑制效果最好，这个时期是香鳞毛蕨孢子成熟期，生长的叶片数也较多。4.5香鳞毛蕨不同采收部位抑菌作用的比较分离香鳞毛蕨不同采集部位根茎、叶、叶柄、鳞毛碎片，碎片使用超声波提取法制成香鳞毛蕨提取液，条件为提

27、取时间5min，提取温度60，50%乙醇浓度。结果发现香鳞毛蕨全株都有抑菌作用，其中鳞毛和散落的孢子抑菌作用最明显，分离的香鳞毛蕨叶片的抑菌作用叶较强，抑菌圈直径可达2.49cm。根茎的抑菌作用最弱，仅达1.38cm。所以我们认为香鳞毛蕨的全株都具有药效，地上部分药效最强。表4-7香鳞毛蕨不同采收部位抑菌作用的比较Table 4-7 Comparing of bacteriostasis of different parts in D.fragrans部位12345平均值根茎鳞毛碎片叶梗全株1.42.62.452.32.31.42.62.52.32.21.42.72.52.42.61.42.7

28、2.52.42.51.32.652.482.52.51.382.652.492.382.42图4-5香鳞毛蕨不同采收部位抑菌作用的比较Fig. 4-5 Comparing of bacteriostasis of different parts in D.fragrans5讨论5.1溶剂及方法的选择提取是进行植物化学研究的第一步。植物化学成分提取方法有:浸渍法、渗浓法、水蒸气蒸馏法、煎煮法、回流法、连续回流法、超临界流体萃取法、超声技术提取法、微波辅助提取法及真空液相层折等。实验中采取的水蒸煮法、醇浸泡法和回流加热法均为传统的提取方法，其原理是根据植物中各种成分在溶剂中的解性质，选用对活性成分

29、溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将活性成分从植物组织内溶解出来的方法。溶剂利用扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了可溶性物质，而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散。这几种提取方法设备简单、操作简便，比较适合少量或中量提取，因此在实验室中较为常用，但相互之间存在优缺点。同时，原料的粉碎度、提取时间、提取温度、设备条件等因素也都能影响提取效率，必须加以考虑。药材粒度应适宜粒度，不宜用过细粉末，主要由于吸附作用增强，影响扩散速度，浸出杂质多，操作困难；药材成分中的小分子成分易浸出，易溶性物质易浸出:浸提时间长，浸出完全，但扩散平衡后，时间不起作用；杂质浸出多

30、，某些成分分解；水为溶剂时长期浸泡易霉变。本研究中超声波法获得的香鳞毛蕨提取液的抑菌效果最好。超声波法的最大优点是大大缩短了提取时间，操作简单。不需要高温浓缩，减少了有效成分在高温下的分解。超声波提取法所需时间是常规提取法的1/12；并且超声波提取法的抑菌圈直径是常规浸提法的1.5倍多。经调查在黑龙江五大连池附近民间将香鳞毛获广泛用于各种皮肤病, 其他地区未见应用,可能与五大连池火山喷发及温泉分布所造成的生态环境有关。参考文献· 1王理达 胡迎庆 等.13种生药提取物及化学成分的抗真菌活性筛选J.中草药,:.· 2丁力 蒋俊康 等.阿莫西林与他唑巴坦联用对128株致病菌株的

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