蛋白质印迹法中免染技术和总蛋白定量方法的研究进展

1、蛋白质印迹法中免染技术和总蛋白定量 方法的研究进展韩欣霖 杨佳儒 宝福凯 柳爱华 昆明医科大学云南省高校热带传染病重点实验室星 明医科大学病原生物学与免疫学系昆明医科大学生 物化学与分子生物学系云南省公共卫生与疾病防控 协同创新中心昆明医科大学热带医学研究所云南 省热带病示范型国际科技合作基地摘要: 当含有蛋白质的sds-page胶浸泡在三氯乙酸或氯仿中时，经三氯化合物的作用, 使得蛋白质中的色氨酸经紫外光照射会发出可见光，因而可在sds-page凝胶上 实现对蛋白质条带的定位与定性。免染技术即是基于此原理而发明的。基于免染 技术，我们可以检测到待测样甜中的总蛋口条带的光密度，进而利用目的蛋口

2、 条带光密度与总蛋白条带光密度的比值对目的蛋白进行定量。本文就蛋白质印迹 法技术中的免染技术和总蛋白定量方法的原理和优势进行简要综述。关键词：免染技术;b 肌动蛋口（b -actin） ; b 微管蛋口（b-tublin）; 甘油醛3- 磷酸脱氢酶（gapdh）;总蛋白定量;作者简介:韩欣霖(1992-),女，硕士研究生;作者简介:杨佳儒(1987-),男，硕士研究生;作者简介:宝福凯,(e-mail)baofukeiikmmu. edu. cn;作者简介:柳爱华,(e-mail)liuaihua.kmmu. edu. cn收稿日期：2017-04-01 基金：国家自然科学基金（8137183

3、5, 31560051, 81560596）progress of stain-free technology and total protein analysis in western blottinghan xinlin yang jiaru bao fu-kai liu ai-huayunnan province key laboratory for tropicalinfectious diseases in universities, kunmingmedical university;abstract：based on the principle that after uv sti

4、mulation, the tryptophan will emit visible light when a sdspage gel containing proteins be soaked in the trichloroacetic acid or chloroform, the stain-free technology was invented. by means of stain-free technology, we can examine the optical density (od) value of total protein in seimples and then,

5、 we can quantify the target protein through utilizing the od value ratios between targct protein and total proteins. here, we summarized the principle and advantages of the stain-free technology and the total protein analysis method.keyword：stain-free technology; b -actin; b -tublin; gapdh; total pr

6、otein analysis;received： 2017-04-01自1979年首次应用以来，蛋h质印迹法(western blot)已成为测定复杂生物 样品屮蛋口质相对表达的关键技术。使用western印迹的生物化学分析是确定复 杂生物样品中相对蛋白表达量的重要工具western印迹通常与大规模筛选技术 如蛋白质组学结合使用，以确认各种疾病模型中不同目的蛋白的表达ul虽然 成像和试剂技术在不断提高灵敏度、动态检测范围和多重目标检测的适用性方面 已经取得了显著进步，但是在最基本的技术上几乎没有变化。在过去，蛋白质印 迹仅用于检测复杂混合物屮的特定靶蛋口，但是现在许多学术期刊要求作者在 样品之

7、间蛋白质表达的倍数变化方面对western印迹数据进行定量解释也。近 年来开发了新方法，涵盖了完整的western c3迹工作流程，重点是样品制备和 数据分析的定量免疫印迹方法。1内参蛋白定量和总蛋白定量的比较蛋口质印迹用于特异性地测量复杂生物样品屮口蛋口的相对表达量。定量测量可 能由于过程不一致而产生误差，例如转膜时蛋白质转移不均匀，包括样品制备 和加样错误，以及转膜时蛋白质转移不均匀。这些非样本相关误差需要通过归一 化的方法来弥补。目前通常采用2种数据标准化方法：内参蛋白(house keeping protein, hkp)标准化和总蛋白标准化(total protein normal

8、ization, tpn)3。1. 1 b -actin等内参蛋白在western印迹实验中不是一个可靠的上样对照£41传统上，由于缺乏累积发光线性和有限的定量再现性，使用ecl (增强化学发光) 的western卬迹被称为半定量技术巨1。随着更敏感的荧光标记的发展，其表现 出比常规ecl检测更大的可量化的线性范围、灵敏度和稳定性，蛋白质表达的分 析可以被合理地称为“定量”凹。因此，必须以更高的精确度确保样品上样的 均匀性，以避免在使用这些更高分辨率的工具时错课的数据采集£11。为了准确 测量样品中的蛋白质水平，“上样对照(loading control) ”蛋白质通常用作

9、 内参。上样对照通常来自普遍表达的看家基因，并且由于它们在不同范围的样品 中特定的一致的表达水平而被广泛使用。b肌动蛋白(b-actin)和甘油醛3- 磷酸脱氢酶(gapdii)是生物医学研究屮最常用的2种内参对照，然而越来越多 的研究表明它们在动物和实验模型中的表达存在差异眩 已有研究表明，在运动神经元病症脊髓性肌萎缩(sma)的小鼠模型的病理学影 响的组织中，3-actin和13-tublin差异表达12-13。该研究使用建立的严重 sma的小鼠模型，从中得到脊髓组织，来量化p-actin和b-tublin的蛋白表 达水平。当使用western印迹定量(qwb)來比较sma小鼠受影响的脊髓

10、与对照 组织时，发现了 3 -actin和p -tublin表达水平的改变。与对照组织相比，sma 组织中的3-actin和3-tublin表达显著下调。该研究从一系列疾病模型的受 累组织中可以检测到对照蛋白表达的显著改变，鉴定了健康(野牛型)组织中 内参蛋白表达的差异性，并口确定了在同一个体内不同组织中内参蛋白的表达 同样存在差异。该实验使用c57b1/6 (野生型)小鼠的研究表明，当比较同一小 鼠的不同组织时，3-actin的表达显著不同。在心脏和脾脏组织之间观察到3-actin蛋白表达的显著差异，当比较这些组织时，将数据归一化用于不同组 织比较，3-actin蛋白表达可以因此导致数据偏斜

11、高达22倍。然而，该实验同 样证明了在某些组织如骨和脂肪之间的p-actin表达存在同源性，也就是说， 在这些组织屮，可以将3-actin作为内参蛋口使用，但也仅在这些特定的组织 中能够使用。例如，鱼类中实时荧光定量pcr (q rt-pcr)的研究与该研究的发 现相一致，该研究证明3-actin在心脏、肌肉和脑的某些组织中不是理想的加 样对照，但其在肾脏和脾脏的表达结果一致，可作为内参蛋白曲。此外，更进 一步的研究表明在不对称组织中，b -actin等常作为加样对照的内参蛋白的表 达量也是不均一的。例如，在比较坐骨神经近端到远端部分时，相比z下，神经 丝(nf-l)(神经元细胞骨架的主要组分

12、)的表达明显更高15,接近8倍，在 坐骨神经的远端部分达到4倍sem。因此 这些结果强调，即使对单个动物的相 同组织用于比较分析吋，解剖的准确性和一致性也是至关重要的。此外，有研究 证明内参蛋口在不同组织或在暴露于感染因子后表达量也不同因此，根据 内参蛋白定量产生的数据可能导致错误的结果。1.2总蛋白定量是一种测定蛋白上样量的精确方法在选择qwb内参过程中需要考虑儿个重要的变量因素，包括敏感度的线性范围、 不同组织或同一组织中蛋白质的表达量差异等。为了确定qwb实验中总蛋白分析 法是否是一种精确、可靠的检测蛋白上样量方法，有研究者用牛血清白蛋白 (bsa)经梯度稀释法建立了蛋口标准品，并以此评

13、估检测灵皱度ill。bsa的相 对分子质量为66 500,在该处可以检测到线性荧光条带，并且在很大的浓度范 围内都存在良好的线性关系，与其0. 998的变异系数一致。重要的是，bsa标准 品溶液有效证明了信号条带的强弱很好地代表了蛋白质上样量的变化。这不仅证 明了使用该方法检测蛋白质的良好线性关系，也证明此方法中不存在通常岀现 于ecl蛋口检测法屮的色彩饱和度问题。最终，当应用licor odyssey定量扫描 系统检测真正的生物样品时，在很大的蛋白浓度范围内检测蛋白质上样量时总 蛋白定量法(使用考马斯亮蓝)都有着优于内参蛋白3-actin和3-tubulin 的良好线性仃40ug) o bc

14、a法和总蛋白定量法的变异系数分别为0. 979和 0. 996,表明这2种方法都具有良好的线性。此外，在蛋h质溶液上样量的范围 大至p40 mg时，总蛋口分析得出的数据仍与bca法所得出的数据具有非常直接 的相关性，进一步说明总蛋白定量是一个非常可靠的蛋白质上样量对照。因此， 我们认为总蛋白定量提供了一种可避免单一蛋白对照所带来的各种问题的测定 蛋白上样量的方法。总蛋白定量的优点如下：(1)在来自不同模型的不同组织中, 它是稳定不变的；(2)在不同类型的组织中，它是稳定的；(3)在同一组织的不 同部位屮，它是稳定的。总蛋口定量是qwb屮一种简单的技术，用来准确地确定 在凝胶内是否已达到等同的蛋

15、白质载量葩。通过总蛋白定量获得的数据避免了 用内参蛋白产生的误差。这并不意味着看家基因不能用做上样对照，在明确掌握 解剖结构和内参蛋白表达的情况下，可以引用内参蛋白，但是相比之下，总蛋 白定量应用的范围和精确度更广更好，因此，建议使用总蛋白定量以节省吋间、 资源，增加灵皱度和准确度，并且不必考虑将内参蛋口作为上样对照时的限制 问题。因此，总蛋白定量应被作为现代荧光定量western印迹中数据标准化的替 代参考标准i171o2免染技术基本概念 2002年，analytical biochemistry上的一篇文章屮第一次提到免染技术 (stain free)。免染技术主要包括2个部分，即免染胶和

16、chemi doc mp全能成 像系统，分析结果时需要image lab软件。免染胶与普通的预制胶不同，免染胶 包含特有的免染技术，因此不能用预制胶代替。样品制备及电泳步骤与普通电泳 一样。电泳后，取出凝胶，置于chemi doc mp全能成像系统中。通过电泳分离 的蛋白经特定波长的紫外线(uv)照射而激活，产生荧光，从而被ccd照相机 捕获，广2 min即能显示总蛋白条带，image lab软件根据蛋白marker自动估算 各条带的相对分子质量和数量。2.1免染技术原理免染技术利用可以在预制胶内使用的化学物质，在凝胶制剂屮掺入三卤代化合 物，当暴露uv辐射时，其催化三卤代化合物和色氨酸残基之

17、间的共价反应。所 得的“活化的”蛋白质在uv激发下发荧光，可以通过合适的成像系统在凝胶内 或在转移到印迹膜之后检测18 o 2. 2免染技术的优点免染技术为western印迹工作流程屮的数据标准化提供了一种新型的质控工具 宜。免染法能够检测和校正实验过程中的误差。免染技术显示出在整个western 印迹过程中的更多优势。通过免染法可在western印迹过程中提前检测到相关严 重问题，并且在抗体孵育之前停止。能够及时检测到抗体孵育之前的凝胶性能和 蛋白质转膜情况，节省大量时间，并且避免之后的资源浪费。免染技术体现了现 有的基于染色法的总蛋白定量方法的优势，常见的tpn染色包括丽春红染色液、 sy

18、pro ruby蛋白质印迹免染和考马斯亮蓝r-350。de medina等报道19丽春红 染液的线性范围高达140 ug,但是其染色时间长，信噪比低，重复性差。 aldridge等检测了 17sypro ruby卬迹染色对脑匀浆的稀释样品（每个泳道 2241 ng蛋白质）的性能，发现染色在其特定工作浓度范围内呈线性。然而， sypro ruby染色需要不断的时间消耗，并且更适用于各泳道大于50 u g的蛋白 上样量owelinder和ekblad报道了迪在免疫检测gapdh后用考马斯亮蓝r-350 作为总蛋白染色方法，它们通过sds-page从细胞裂解物中分离225 ug总蛋白， 证明了该染色

19、法在该范围内的线性。然而，它们的总蛋白染色方法仅限于pvdf 膜，因为考马斯亮蓝染色导致硝酸纤维素膜上非常高的背景。免染技术的另一个显著优点是快速显现凝胶电泳分离蛋口质和转膜的能力。此外, 免染技术兼容硝酸纤维素膜和pvdf膜。免染技术以成像系统标准化和无偏差的 方式进行数据采集处理。数据标准化的传统方法是基于各种hpk的表达水平一致 的认识之上，但目前利用免染技术进行总蛋白定量被认为是检测细胞裂解物总 蛋白质含量的良好代表。越来越清楚的是，hpk方法在其-般适用性方面受到限 制。任何蛋口质作为标准化对照的第一个先决条件是证明在所研究的样品屮稳定 表达20。因此，合适的内参蛋白选择需要消耗一定

20、的时间去验证及11。此外， 基于hkp的标准化需要对抗体稀释、孵育时间和成像设置进行优化。与免染技术 相比，这是一个非常漫长的过程，免染技术总蛋白定量的方法提供了精确的蛋 白质上样载量，而不需要长吋间的优化完善。此外，hkp定量方法基于每个电泳 道的单个蛋口质的比较，而免染技术的总蛋口质定量方法利用了给定蛋口质样 甜中的所有信息。3蛋白样品制备是实验可信度的先决条件 蛋白样品的制备可直接影响蛋白质印迹上条带的光密度，以下列出几项蛋白样 品制备时可能遇到的问题：（1）组织或细胞样本的处理不当会导致蛋白质样品 降解和/或表达；（2）裂解缓冲液中清洗剂、盐和蛋白酶抑制剂不足；（3） bca 试剂盒测

21、定蛋白浓度不准确。由于蛋白裂解物与污染物如细胞或组织碎片、脂肪、疏水蛋白聚集体、核酸和蛋 口酶的复杂性，可对western印迹结果产生直接和负而的影响，因此使用细胞 裂解缓冲液和匀浆技术消除其影响非常重要竺1。通常，含有非离子洗涤剂如 np-40和triton x-100的缓冲液比离子洗涤剂如sds和脱氧胆酸钠产牛的刺激 更小。通常加入浓度为100150 mmol/l的盐（如nacl或kc1）以防止蛋白质 凝集。ripa 缓冲液1%np-4o 或 triton x-100, 1%脱氧胆酸钠，0. 1%sds, 150 mmol/l na cl, 50 mmol/l tris-hcl （p h7

22、. 8） , 1 mmol/l edta和蛋口酶抑制 剂混合物用机械或手动仪器产生匀浆，这可以为western印迹结果的测定提供 可靠的数据。组织匀浆技术的正确选择是western印迹测定成功的先决条件，并 且所采用的方法完全取决于样品类型。其中一个方法是，对于细胞裂解，将沉淀 的细胞（在细胞悬浮液的情况下）加入冰冷（4°c）的ripa缓冲液或铺板的细 胞中，将细胞洗涤后，将冰冷的ripa缓冲液直接加入板中，刮下并吸取细胞。 来自细胞或组织裂解物的匀浆的总蛋白浓度应使用bca法测定。理想地，匀浆将 被稀释至至少2 mg/m l的浓度，这将允许每个泳道1080 ug 1 mm厚的微型聚

23、 丙烯酰胺sds凝胶上样。4结语蛋白质卬迹分析是最广泛使用的对目的蛋白质进行半定量测定的方法之一。 western印迹实验耗时长，包含许多操作步骤（如蛋白质浓度测定、sds-page、 转膜），会增加很多带入误差的几率宜。为了准确比较蛋白质印迹信号，必须 补偿信号强度（与样品本身无关），这种方法被称为归一化，并且在本领域屮 被广泛运用。使用蛋白质印迹的蛋白质的半定量通常涉及针对看家蛋白（如 3-actin）的标准化。为了校正可能存在的蛋白质上样的不准确性，一般都会增 加具有相对恒定表达的“看家蛋白”作为内参载量对照。这些蛋白质在许多不同 的样品中含量丰富，并口它们的表达水平通常被认为对各种生理

24、条件和处理的 影响不皱感。2种最常用的内参对照是p-actin和gapdi1。然而，几个最近的报 告表明，以看家蛋白作为内参对照须仔细评估。选择hkp时应当谨慎，因为不是 所有的hkp表达水平在实验条件或不同样品类型的变化下保持恒定，常用于数 据标准化的 hkp 包括 p-actin23> ptublin24和 gapdh25。tpn 利用加 载在给定泳道中的整个样品的信号强度作为靶蛋白信号的加载对照。由于在各种 实验条件下存在hkp表达变化的可能，通常建议使用多个hkp标准化western 印迹结果，从而增加实验的时间和复杂性。相比之下，tpn的使用具有使单个蛋 白质的表达变化的影响最

25、小化的优点。最近，丽春红染色和考马斯亮蓝染色己被 证明是作为上样对照的管家基因的合适替代物。免染技术的总蛋白染色具有无须 染色或脱色步骤的优点。使用免染技术作为p-actin或蛋白质染色液的替代品 的评价显示，基于免染法总蛋口定量的方法优于3-actin等内参蛋口，并且优 于作为蛋白质印迹上样对照的丽春红染色等染色方法。通过良好的样品制备技术、检测方法、软件和分析的共同协作，能够实现蛋白质 印迹的准确密度计量分析，这些分析最终能够产牛十分满意的结果。为了获得最 大程度的重复和完整性，强烈推荐运用基于免染技术的总蛋白定量方法，因为 这种方法为免疫印迹实验过程屮数据的精确标准处理提供了新颖独特的质

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