固定化酶及固定化技术

1、1会计学固定化酶及固定化技术固定化酶及固定化技术第1页/共132页l19161916年，美国科学年，美国科学家发现，家发现，酶和载体酶和载体结合以后结合以后，在水中，在水中呈不溶解状态时，呈不溶解状态时，仍然具有生物催化仍然具有生物催化活性活性。 固定化酶可重复使用固定化酶可重复使用操作稳定性操作稳定性 酶在固定化后其活力可以缓慢释放酶在固定化后其活力可以缓慢释放, , 酶的稳定性比天然状态高酶的稳定性比天然状态高, , 可重可重复多次使用复多次使用. .第2页/共132页例:将0.5g DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶与10mL 1%壳聚糖溶液在60下连续反应10 次每次反应时间为6h 每次反

2、应后分别测定酶活力第3页/共132页水溶性水溶性酶酶水不溶性载水不溶性载体体固定化固定化技术技术水不溶性水不溶性酶酶（固定化（固定化酶）酶）什么是固定化什么是固定化酶？酶？第4页/共132页第5页/共132页与固定化酶技术相与固定化酶技术相配套的是酶生物反应配套的是酶生物反应器器同一般的化工容器一样，需要对酶反应同一般的化工容器一样，需要对酶反应器温度和器温度和pHpH等条件进行严格的控制；不等条件进行严格的控制；不同的是，酶反应器必须进行无菌操作。同的是，酶反应器必须进行无菌操作。第6页/共132页第7页/共132页第8页/共132页第9页/共132页固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：固定

3、化酶同自由酶相比，具有以下优点：第10页/共132页缺点：缺点：第11页/共132页固定化时要采取尽量温和的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。基本原则基本原则：第12页/共132页第13页/共132页四大类方法：四大类方法：吸附法（包括电吸附法）吸附法（包括电吸附法）结合法（无机多孔材料）结合法（无机多孔材料）交联法（双功能试剂）交联法（双功能试剂） 包埋法（微胶囊法）包埋法（微胶囊法）第14页/共132页SMS:一种硅酸盐载体有机载体：纤维素、骨胶原、火有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶棉胶无机载体：氧化铅、皂土、白土无机载体：氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、高岭土、多孔玻璃、硅藻土、

4、二氧化钛等硅藻土、二氧化钛等第15页/共132页第16页/共132页第17页/共132页l这是酶与载体以共价键结合的固这是酶与载体以共价键结合的固定化方法，是载体结合法中报道定化方法，是载体结合法中报道最多的方法。最多的方法。l归纳起来有二类：归纳起来有二类：l将载体有关基团活化，然后与将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。酶有关基团发生偶联反应。l在载体上接上一个双功能试剂在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。，然后将酶偶联上去。( (与交联与交联法合用）法合用）第18页/共132页酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间

5、形成共价键而固定的方法。价键而固定的方法。第19页/共132页l可以形成共价键的基团：可以形成共价键的基团： 游离氨基，游离氨基， 游离羧基，游离羧基， 巯基，巯基， 咪唑基，咪唑基， 酚基，酚基， 羟基，羟基， 甲硫基，甲硫基， 吲哚基，二硫键吲哚基，二硫键l常用载体：天然高分子、人工合成的高常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体聚物、无机载体第20页/共132页首先载体上引进活泼基团首先载体上引进活泼基团 然后活化该活泼基团然后活化该活泼基团 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键价键关键关键载体活化载体活化活化基团酶分子基团活化基团

6、酶分子基团第21页/共132页酶分子和载体连接的功能基团：酶分子和载体连接的功能基团：酶蛋白酶蛋白N-N-端的端的- -氨基或赖氨酸残氨基或赖氨酸残基的氨基基的氨基酶蛋白酶蛋白C-C-端的羧基以及端的羧基以及AspAsp残基的残基的- -和和- -羧基羧基CysCys残基的巯基残基的巯基SerSer、TyrTyr、ThrThr残基的羟基残基的羟基PhePhe、TyrTyr残基的苯环残基的苯环HisHis残基的咪唑基残基的咪唑基TrpTrp残基的吲哚基残基的吲哚基第22页/共132页第23页/共132页第24页/共132页lA A重氮法重氮法lB B叠氮法叠氮法lC C烷基化反应法烷基化反应法l

7、D D硅烷化法硅烷化法lE E溴化氰法溴化氰法载体活化的方法载体活化的方法第25页/共132页l优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。或存在盐类等原因而轻易脱落。l缺点：缺点：l该方法反应条件苛刻，操作复杂；该方法反应条件苛刻，操作复杂；l由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构变化，因此往往不能得到比活高的白高级结构变化，因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回收率一般为固定化酶，酶活回收率一般为3030左右，甚至左右，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。底物的

8、专一性等酶的性质也会发生变化。l只能用于酶，不能用于微生物的固定化只能用于酶，不能用于微生物的固定化第26页/共132页是指通过双功能试剂，将是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法酶和酶联结成网状结构的方法OH (CH2)3CH O+ E-CH=N-E-N=CH(CH2)3CH=N-E-N=CH-NCH(CH2)3CHN-CH=N-E-N=CH(CH2)3CH=N-E-N=CH-交联法使用的交联剂是交联法使用的交联剂是戊二醛、己二胺、双偶戊二醛、己二胺、双偶氮苯等水溶性化合物。氮苯等水溶性化合物。第27页/共132页戊二醛的两个醛基都可以与酶或者蛋白质的游离氨基酸反应，形成Schif

9、f碱，从而使酶或者菌体蛋白交联，形成固定化酶或固定化菌体。第28页/共132页第29页/共132页用第30页/共132页酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子酶分子: :（a a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶不溶性的固定化酶（b b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶酶第31页/共132页第32页/共132页网格法网格法将酶分子或微生物包埋在凝胶格子里。将酶分子或微生物包埋在凝胶格子里。天然

10、凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等。合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等。网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。第33页/共132页第34页/共132页半透膜包埋法（微囊化法）：半透膜包埋法（微囊化法）： 将酶包埋在有各种高分子聚合物制将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，制成固定化酶。成的小囊中，制成固定化酶。 半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜等半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜等第35页/共132页微囊发生微囊发生器器第36页/

11、共132页第37页/共132页第38页/共132页比较项目比较项目吸附法吸附法结合法结合法 交联法交联法包埋法包埋法物理吸物理吸附附.共价键结共价键结合合离子键结离子键结合合 制备难易制备难易易易难难易易 较难较难较难较难固定化程固定化程度度弱弱强强中等中等 强强强强活力回收活力回收率率较高较高低低高高 中等中等高高载体再生载体再生可能可能不可能不可能可能可能 不可能不可能不可能不可能费用费用低低高高低低 中等中等低低底物专一底物专一性性不变不变可变可变不变不变 可变可变不变不变适用性适用性酶源多酶源多较广较广广泛广泛 较广较广小分子小分子底物、底物、药用酶药用酶第39页/共132页第40页/

12、共132页其他固定化酶方法l结晶法：结晶法：l分散法：分散法：l热处理法热处理法l等等等等第41页/共132页(3)固定化酶的半衰期 衡量操作稳定性的关键.第42页/共132页固定化酶的过程中还存在几个亟待解决固定化酶的过程中还存在几个亟待解决解决的难题解决的难题 ：n第43页/共132页固定化技术的改进固定化技术的改进n等等第44页/共132页第45页/共132页第46页/共132页成成分分参数参数酶酶生物化学性质：生物化学性质：分子量，辅基，蛋白质表面的功能基团，纯度（杂质的失活或保分子量，辅基，蛋白质表面的功能基团，纯度（杂质的失活或保护作用）护作用）动力学参数：动力学参数：专一性，专一

13、性，pHpH及温度曲线，活性及抑制性的动力学参数，对及温度曲线，活性及抑制性的动力学参数，对pHpH，温，温度，溶剂，去污剂及杂质的稳定性度，溶剂，去污剂及杂质的稳定性。载载体体化学特征：化学特征：化学组成，功能基，膨胀行为，基质的可及体积，微孔大小及载化学组成，功能基，膨胀行为，基质的可及体积，微孔大小及载体的化学稳定性体的化学稳定性 机械性质：机械性质：颗粒直径，单颗粒压缩行为，流动抗性（固定床反应器），沉降颗粒直径，单颗粒压缩行为，流动抗性（固定床反应器），沉降速率（流体床），对搅拌罐的磨损。速率（流体床），对搅拌罐的磨损。固固定定化化酶酶固定化方法：固定化方法： 所结合的蛋白所结合的蛋

14、白, ,活性酶的产量活性酶的产量, ,内在的动力学参数内在的动力学参数质量转移效应质量转移效应: :分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给出了游离酶在合适反应条件下的效率。孔）扩散效应；这些给出了游离酶在合适反应条件下的效率。稳定性稳定性: :操作稳定性操作稳定性( (表示为工作条件下的活性降低表示为工作条件下的活性降低) )，贮藏稳定性，贮藏稳定性效能效能: :生产力（产品量生产力（产品量/ /单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数/ /公斤公斤产品）产品）第47页

15、/共132页第48页/共132页第49页/共132页第50页/共132页DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶纤维素固定化壳聚糖酶: :以以DEAE DEAE 纤维素为载纤维素为载体戊二醛为交联剂固定壳聚糖酶体戊二醛为交联剂固定壳聚糖酶第51页/共132页第52页/共132页一般认为高分子底物受到一般认为高分子底物受到空间位阻的影响空间位阻的影响比低比低分子底物大。分子底物大。第53页/共132页l不过，也有个别情况，酶在不过，也有个别情况，酶在固定化后反而比原酶活力提固定化后反而比原酶活力提高，原因可能是偶联过程中高，原因可能是偶联过程中酶得到化学修饰，或固定化酶得到化学修饰，或固定化过程提高了酶的

16、稳定性。过程提高了酶的稳定性。第54页/共132页分子底物不能过膜与酶接近。第55页/共132页第56页/共132页第57页/共132页固定化酶的稳定性变化固定化酶的稳定性变化1.1.固定化酶；固定化酶；2. 2. 自然酶自然酶第58页/共132页l测试结果测试结果:5:5天后其活性仍可保留天后其活性仍可保留96% .96% .例例:将将DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶纤维素固定化壳聚糖酶浸泡在浸泡在95%的的乙醇乙醇中，中，连续连续5天测其催化活性天测其催化活性 第59页/共132页第60页/共132页n固定化酶的pH稳定性明显优于游离酶。第61页/共132页第62页/共132页第63页/共1

17、32页对操作稳定性都有影响对操作稳定性都有影响第64页/共132页 如图：固定化酶的最如图：固定化酶的最适温度为适温度为6060C C ，而游，而游离酶的最适温度为离酶的最适温度为5050C C 而固定化酶在而固定化酶在50- 6550- 65C C 范围内都保持了较高的范围内都保持了较高的酶活力酶活力, ,这说明壳聚酶经这说明壳聚酶经固定化后其在较高温度固定化后其在较高温度下的适应范围有了明显下的适应范围有了明显提高提高固定化后，酶的热稳定性提高固定化后，酶的热稳定性提高，所以固定化酶的最适温度提，所以固定化酶的最适温度提高高当然，也有报道最适温度不变或下降的。当然，也有报道最适温度不变或下

18、降的。第65页/共132页第66页/共132页l1 1） 载体带负电荷，载体带负电荷，pHpH向碱性方向移动。向碱性方向移动。 载体带正电荷，载体带正电荷，pHpH向酸性方向移动。向酸性方向移动。（2 2）产物性质对体系）产物性质对体系pHpH的影响的影响l催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pHpH比游离酶的最适比游离酶的最适pHpH值；反之则低值；反之则低第67页/共132页可见：固定化酶的最适可见：固定化酶的最适pH pH 向酸性偏移向酸性偏移第68页/共132页可见：固定化酶的最适可见：固定化酶的最适pH pH 向碱性偏移向碱性偏移第69页/共1

19、32页第70页/共132页第71页/共132页糖酶的米氏常数的影响较酶经固定化后所产生的空间扩散阻力对酶的米氏常数的影响小 ，所以最后酶Km提高。第72页/共132页第73页/共132页第74页/共132页由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测定残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力定残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力，所以，仍以测定蛋白量较为难确。，所以，仍以测定蛋白量较为难确。第75页/共132页。5.相对酶活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力第76页/共132页保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，因而更

20、稳定。保持了胞内原有的多酶系统，而且无需辅酶再生。第77页/共132页第78页/共132页分类方分类方式式固定化细胞类型固定化细胞类型细胞类细胞类型型微生物、植微生物、植 物、动物、动 物物生理状生理状态态死细胞：完整细胞，细胞碎片，细死细胞：完整细胞，细胞碎片，细胞器胞器活细胞：增殖细胞，静止细胞，饥活细胞：增殖细胞，静止细胞，饥饿细胞饿细胞第79页/共132页第80页/共132页第81页/共132页第82页/共132页第83页/共132页第84页/共132页第85页/共132页1 1、可增殖，细胞密度大，可获得高度密、可增殖，细胞密度大，可获得高度密集而体积小的生产菌集合体集而体积小的生产

21、菌集合体 2 2、发酵稳定性好，可以较长时间反复使、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用用或连续使用3 3、发酵液中含菌体较少，有利于产品分、发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化。离纯化。( (膜的选择通透性）膜的选择通透性）4 4、有利于需要辅酶和多酶系统才能进行、有利于需要辅酶和多酶系统才能进行的反应的反应5 5、抗污染能力强、抗污染能力强第86页/共132页(1)(1)必须保持菌体完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。必须保持菌体完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。(2)(2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同

22、时，需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成。他酶的活性止副产物的形成。(3)(3)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用, ,载体形成的孔隙载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性大小影响高分子底物的通透性. .(4)(4)如利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要如利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物；的副产物；但这些缺点并不影响它的实用价值。但这些缺点并不影响它的实用价值。 第87页/共132页缺点：缺点：固定化后的细胞不易与反应物接近，可能导致反应效果下降固定化后的细胞不易与反应物接近，可能导致反应效果下降第88

23、页/共132页第89页/共132页 1 1、在工业上的应用、在工业上的应用用固定化酶可以生产用固定化酶可以生产L-L-氨基酸，葡萄糖及葡糖浆、核苷酸氨基酸，葡萄糖及葡糖浆、核苷酸、半合成的抗生素母核等、半合成的抗生素母核等L L氨基酸的生产：用固定化酶（氨基酰化酶）折分氨基酸的生产：用固定化酶（氨基酰化酶）折分DLDL氨基酸可连续生产氨基酸可连续生产L L氨基酸。如固定化的细胞（大肠杆氨基酸。如固定化的细胞（大肠杆菌）生产菌）生产L LAspAsp：以：以120L120L柱式反应器柱式反应器6060天可生产天可生产5 5吨的吨的L LAspAsp。第90页/共132页乙酰乙酰 -DL -Ala

24、 L -Ala +乙酸乙酸 乙酰乙酰 -D Ala （A-D-Ala）Aminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶第91页/共132页泵泵储罐反应产物离心离心机机消消旋旋反反应应器器固定化酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala第92页/共132页第93页/共132页人工肾人工肾：第94页/共132页治疗癌治疗癌症症l正常细胞：正常细胞：L-AsnL-Asn合成酶，合成酶，AsnAsn被消被消耗的同时不断合成维持细胞蛋白质耗的同时不断合成维持细胞蛋白质合成需要合成需要l癌细胞：缺少活无癌细胞：缺少活无L-AsnL-Asn合成酶，合成酶， AsnA

25、sn被消耗，影响蛋白质合成，细胞被消耗，影响蛋白质合成，细胞“饿死饿死”用固定化的用固定化的天冬酰胺酶天冬酰胺酶治疗治疗白血病白血病第95页/共132页第96页/共132页微囊型固定化酶微囊型固定化酶这就避免了发生过敏性反应。第97页/共132页 胶囊型固定化胶囊型固定化 酶的另一大酶的另一大优点优点是，是，胶囊内的酶仍以胶囊内的酶仍以溶解状态作用于底物溶解状态作用于底物。因此突破了狭义的固定化酶的。因此突破了狭义的固定化酶的定义，也为固定化酶应用于临床提供了可能性。定义，也为固定化酶应用于临床提供了可能性。 与此同时，人们采用人血清白蛋白替代尼龙、硝酸与此同时，人们采用人血清白蛋白替代尼龙、

26、硝酸纤维等作为制造胶囊的材料，使包装材料更具有安全纤维等作为制造胶囊的材料，使包装材料更具有安全、稳定和体内易代谢等特点。、稳定和体内易代谢等特点。第98页/共132页 是一种与是一种与x x染色染色体连锁的遗传代体连锁的遗传代谢病谢病 患者由于先天患者由于先天性缺乏性缺乏HGPRTHGPRT，导，导致体内次黄嘌呤致体内次黄嘌呤和鸟嘌呤补救途和鸟嘌呤补救途径的障碍，并进径的障碍，并进而引起肾结石、而引起肾结石、痛风。痛风。 Lesch-NyhanLesch-Nyhan综综合症合症第99页/共132页 ChangChang等人利用等人利用微囊型微囊型嘌呤氧嘌呤氧化酶治疗化酶治疗Lesch-Nyh

27、anLesch-Nyhan综合症，综合症，使次黄嘌呤的水平显著下降，同使次黄嘌呤的水平显著下降，同时发现次黄嘌呤能很快地进时发现次黄嘌呤能很快地进入入微微囊体囊体中并被代谢。中并被代谢。 在以两岁半在以两岁半大的病孩所做的临床试验中，他大的病孩所做的临床试验中，他们也发现效果很好。们也发现效果很好。第100页/共132页第101页/共132页点是从时间和空间分布上控制药物的释放。第102页/共132页体药物第103页/共132页照组延长2倍左右。第104页/共132页效应，n生物利用度高，作用时间长。第105页/共132页性。第106页/共132页变。微球还可用于基因治疗及基因疫苗的载体。第1

28、07页/共132页第108页/共132页 现查明是因缺乏氨基己糖酶现查明是因缺乏氨基己糖酶A A，使神经节苷脂累积在组，使神经节苷脂累积在组织内，从而出现神经迟钝、肌肉无力、失聪、视网膜有织内，从而出现神经迟钝、肌肉无力、失聪、视网膜有樱桃红点等症状樱桃红点等症状. . 黑蒙性痴呆黑蒙性痴呆(Tay-(Tay-SachSach病病) )第109页/共132页 Weisman Weisman等用被覆抗体的脂质等用被覆抗体的脂质体（内含氨基己糖酶体（内含氨基己糖酶A A）引入到）引入到4 4例黑蒙性痴呆患者细胞中，此时例黑蒙性痴呆患者细胞中，此时细胞不会把含酶的细胞不会把含酶的脂质体脂质体当作异当

29、作异物。故能通过细胞膜进入细胞内物。故能通过细胞膜进入细胞内，在细胞内发挥酶的作用，在细胞内发挥酶的作用。 第110页/共132页 此外，还有人利用嵌入此外，还有人利用嵌入从胎盘中提纯的葡萄糖脑苷从胎盘中提纯的葡萄糖脑苷酯酶的脂质体来治疗酯酶的脂质体来治疗GaucherGaucher病，发现也能获得病，发现也能获得较好的疗效。较好的疗效。 第111页/共132页第112页/共132页第113页/共132页第114页/共132页半透膜酶胶层感应电极酶电极示意图 在分析化学与临床诊断中，固定化酶被制成酶试纸、酶在分析化学与临床诊断中，固定化酶被制成酶试纸、酶柱与酶管、酶电极而得到广泛的应用。柱与酶

30、管、酶电极而得到广泛的应用。第115页/共132页主要集中在酶本身的生化和分子生物学研究以及蛋白质、主要集中在酶本身的生化和分子生物学研究以及蛋白质、核酸和遗传工程中的研究应用。核酸和遗传工程中的研究应用。 此外，固定化酶及其技术，还可以用于研究微生物的代谢此外，固定化酶及其技术，还可以用于研究微生物的代谢机理，研究生物发光机理等。机理，研究生物发光机理等。 第116页/共132页第117页/共132页第118页/共132页8 M尿 素透 析第119页/共132页固定化衍生固定化衍生物物活力活力蛋白质蛋白质比活比活全酶全酶1001004.5亚基亚基9.827.51.6第120页/共132页。第121页/共132页第122页/共132页第123页/共132页缺点：缺点：第124页/共132页用第125页/共132页成成分分参数参数酶酶生物化学性质：生物化学性质：分子量，辅基，蛋白质表面的功能基团，纯度（杂质的失活或保分子量，辅基，蛋白质表面的功能基团，纯度（杂质的失活或保护作用）护作用）动力学参数：动力学参数：专一性，专一性，pHpH及温度曲线，活性