拟南芥AtWNK9基因定位和表达研究

1、拟南芥atwnk9基因定位和表达研究基金项目：国家自然科学基金资助项目 (31171176)；湖南省自然科学基金资助项目(11jja002)； 青年教师成长计划项目(531107040602)作者简介：赵小英(1973-),女，湖南慈利人，湖南大 学副教授摘要：atwnk9 为拟南芥 wnk (with no lysine kinase) 激酶家族成员，其功能尚不清楚采用生物信息学和生物学实 验相结合的方法，对atwnk9蛋白结构、亚细胞定位、启动 子元件、基因表达模式进行了分析研究发现，atwnk9定位在 细胞核中；该基因在拟南芥根中高效表达，其表达受aba, nacl、葡萄糖、热和冷等非生

2、物胁迫处理强烈诱导结果表明, atwnk9为非生物胁迫反应相关基因，并可能参与根的生长发 育关键词：基因表达；拟南芥；atwnk9中图分类号：q94文献标识码：awnk 激酶(with no lysine kinase)是一种丝氨酸/苏 氨酸蛋白激酶，属于蛋白激酶家族成员之一，因其家族成员 在激酶功能域缺乏保守的赖氨酸而得名该激酶家族成员在 通常保守的位于激酶区域第二个亚结构域缺乏一个赖氨酸 残基，动物wnk激酶中赖氨酸被半胱氨酸所替代，在植物中 常被天冬酰氨（n）或丝氨酸（s ）替代，但激酶的生物 活性没有发生变化，因此表明wnk激酶是一种特殊的蛋白激 酶nakamichi等在双子叶植物拟南

3、芥中克隆到植物中第一 个wnk基因atwnkl,随后又成功分离到了 atwnk2-98个wnk 基因，并发现atwnk2, atwnk4, atwnk6涉及拟南芥昼夜节 律的调控过程atwnk2, atwnk5, atwnk8的tdna插入突变导 致拟南芥早开花，atwnkl的tdna插入突变表现出了晚花的 表型最新研究发现，破坏atwnk8能提髙拟南芥对盐和渗透 压力的抗性目前，在单子叶植物水稻中发现7个wnk基因, 其中oswnkl被发现参与各种非生物胁迫如冷、热、盐、干 旱胁迫等wang等在大豆中鉴定了一个根特异性的wnk同源 基因,gmwnk 1,它通过与aba分解代谢相关的蛋白gmc

4、yp707a 1 相互作用微调aba的水平，从而调控大豆晚期侧根的发育随 后又发现gmwnk 1能增强植物对nacl和渗透压的抗性目前， 有关拟南芥atwnk9基因的功能尚处于未知状态，因此系统 研究atwnk9基因的功能对全面了解拟南芥wnk激酶的功能 具有十分重要的意义生物信息学作为研究过程中的一项技术和开发工具在 核酸及蛋白质序列分析及功能预测中发挥重要的作用基因 蛋白结构与表达的生物信息学分析结果对后续基因功能研 究有重要的指导意义本研究采用生物信息学和生物学实验 相结合的手段，对atwnk9蛋白结构、亚细胞以及基因表达 情况进行了分析，这将为进一步研究该基因的功能奠定基础1材料与方法

5、11植物材料和载体拟南芥野生型col4为哥伦比亚生态型，大肠杆菌dh5a 菌株和pa7yfp载体均为本实验室保存12生物信息学分析运用简单模块构架搜索工具smart (simple modular architecture research tool )( http :/smartemblheidelbergde/smart/)和 ncbi 网站提供的保 守结构域检索工具 cdart (conserved domain architecture retrieval tool) (http： /wwncbin 1 mnihgov/strueture/) 对atwnk9蛋白进行保守结构域分析；利用

6、丹麦科技大学 (dtu)的 cbs 服务器上的 netphos20 server 程序(http： /mvcbsdtudk/services/netphos/)分析磷酸化位点；利 用 wolfpsort 工具(http： /wolfsortseqcbrcjp)和 tair 网站中提供的蛋白亚细胞定位数据库suba ( the subcellular proteomic database )( http :/suba2plantenergyuwaeduau/ )预测蛋白质亚细胞定位 13-14；通过 tair 网站中提供的 arabidopsis efp browser 链接(http： /bb

7、cbotanyutorontoca/efp/)分析 atwnk9 基因的表达谱15利用植物plant care在线分析工具(http:/bioinformaticspsbugentbe/webtools/plantcare/ ) 对 atwnk9基因上游1 000 bp的启动子顺式作用元件进行分析 1613 35s：: atwnk9yfp融合表达载体构建以拟南芥野生型col4为材料，采用rtpcr方法，首先 提取总rna并逆转录为cdna,然后以此cdna为模板，利用 引物 atwnk9yfpf(acgcgtcgacatgatgaacaatctc agccatctt), atwnk9yfpr

8、(ggactagtgt cttcttcgtcagag tcgttt)(下划 线碱基部分分别为sal i和spe i酶切序列)，通过pcr扩增 得到atwnk9目的基因的全长cdna序列采用酶切连接的克隆 方法，将该片段连接到pa7yfp载体中，构建绿色荧光蛋白 与atwnk9基因融合表达的载体35s： atwnk9yfp14peg介导的原生质体转化为确定atwnk9基因在细胞中表达的具体部位，将上述 构建的35s： atwnk9yfp进行原生质体转化参照文献17的 方法，将未抽台前的叶片约90片，切成1mm宽的长条(长 度不定)，置于500 mmol甘露醇溶液中将细条捞出，置于含 有纤维素酶和

9、果胶酶的酶解液中，黑暗23 °c, 4050 r/min 解析3 h以制备原生质体取约1020 ug 35s： atwnk9yfp 质粒于15 ml离心管中，随后依次加入100 ul的原生质体 和110 p l peg/ca溶液，轻柔混匀放置2030 min后，去除 peg,用 w5 溶液(154 mm nacl, 125mmcac12, 5mmkcl, 2 mm mes)终止反应，然后置于云孔板内23 °c黑暗下培养 618h后，在荧光倒置显微镜下观察和分析atwnk9的亚细 胞定位15胁迫处理拟南芥野生型col4种子经深层(1%次氯酸钠10 min, 无菌水洗5次)消毒

10、后，4 °c春化34 d,然后播种在ms 培养基上放置在2223 °c培养箱连续白光培养12 d后，用 aba (100 um) 18nacl (300 mm) 19、葡萄糖(2%) 20、 热(3721、冷(4 °c) 22进行处理，清水处理作 为对照，在不同的时间点收取材料，液氮速冻后，于-80 °c 保存，用于后续的实时定量pcr分析16实时定量pcr分析采用 trigene (genstar)提取总 rna,按照 maxima first strand cdna synthesis kit (fermentas)试剂盒提供的 方法，反转录合成cd

11、na在定量pcr仪(mx3 000 p)上，按 照 sybr premix ex taqtm (perfect real time) (takara) 定量试剂盒的说明进行定量pcrpcr反应条件为：94 °c预 变性 10 min, 94。(2变性 30 s, 57 °c退火 30 s, 72。(3延 伸30 s, 40个循环每个实验至少重复3次，持家基因actin2 作为分子内标本研究采用的定量pcr引物见表12结果21atwnk9蛋白结构分析运用简单模块构架搜索工具smart和ncbi中的cdart 软件对atwnk9蛋白进行保守结构域分析，发现atwnk9在第 25

12、到第282个氨基酸区域，包含了一个保守的丝氨酸苏氨酸 激酶催化结构域(stykc)和一个蛋白激酶催化结构域(pkc) (图1 (a),因此，atwnk9被归类为丝氨酸苏氨酸蛋白激 酶家族利用丹麦科技大学(dtu)的cbs服务器上的netphos20 server程序对atwnk9蛋白进行磷酸化位点分析从图中可看 出，atwnk9蛋白氨基酸序列中的17个丝氨酸(s), 2个苏 氨酸(thr)和7个酪氨酸(tyr)蛋白激酶磷酸化位点(图 1 (b)这说明atwnk9具有自身磷酸化的特点22a1wnk9基因亚细胞定位分析采用wolf ps0rt工具对atwnk9的亚细胞定位进行预测, 得知atwnk

13、9定位在胞质中；采用tair网站中提供的蛋白亚 细胞定位数据库suba进行预测，得知该基因定位在细胞核 中为进一步确定atwnk9的亚细胞定位，我们采用peg介导 的原生质体转化方法17进行了分析研究首先，采用pcr扩增，得到atwnk9的全长cdna序列， 大小为1 400 bp左右(图2 (a)用限制性内切酶sal i和 spe i将该片段和pa7yfp载体进行双酶切，分别得到大小为 4 900左右和1 400 bp左右的酶切片段(图2 (b)回收酶 切片段，用t4dna连接酶进行连接反应将反应液转化大肠杆 菌dh5 a ,然后对阳性克隆进行pcr和双酶切(hindlll和 bamh i

14、)鉴定，pcr产物及酶切片段大小与预期片段大小相 一致(图 2 (c), (d),表明成功构建了 35s： atwnk9yfp 重组质粒随后，以载体35s： yfp质粒作为对照，将重组质 粒35s： atwnk9yfp转化拟南芥原生质体，在荧光倒置显微 镜下观察融合基因的表达情况(图3)绿色荧光蛋白基因yfp 在细胞的所有部位都高效表达(图3 (b),融合基因 atwnk9yfp则仅在细胞核中表达较强(图3 (d),与蛋白亚 细胞定位数据库suba预测结果相一致，表明atwnk9编码核 蛋白23atwnk9组织器官表达模式分析基因的时空表达模式可为预测和研究其生物学功能提供参考依据根据tair

15、网站中efp browser连接 提供的数据，对atwnk9基因在拟南芥不同组织器官中的表 达谱进行了分析整理(图4 (a) atwnk9基因在拟南芥植株 的根、下胚轴、叶、花等各个组织器官中均有不同水平的表 达，在根中的表达量最高此外，atwnk9在不同部位的叶片、 茎、花和花粉中的表达也存在一定的差异但表达水平都比较 低(图4 (a)为了进一步确定atwnk9基因在不同组织器 官的表达模式，采用实时荧光定量pcr检测了该基因在拟南 芥根、莲座叶、茎生叶、茎、花和果荚中的表达情况从图4 (b)中可看出，atwnk9在所有被检测的组织器官中均有表 达，其中在根中的表达量最高，约为其它器官中的3

16、5倍, 其次为茎这与efp browser连接提供的数据基本一致，推测 atwnk9可能参与根的生长发育24 atwnk9基因表达对非生物胁迫的响应利用植物启动子顺式作用元件分析网站plant care在 线分析了 atwnk9基因上游1 000 bp的调控区域结果发现， atwnk9基因的调控区域存在大量激素响应与胁迫响应相关 的元件，包括赤霉素反应元件(gibberellinresponsive element, gare)、热胁迫响应元件(hse)、逆境和胁迫响 应元件(tcrichrepeats)等顺式作用元件为了研究atwnk9基因的表达是否响应激素、逆境胁迫, 实验中对12龄拟南芥

17、幼苗分别进行aba、盐、葡萄糖、热、 冷胁迫处理，采用实时定量pcr分析了 atwnk9基因的表达 情况结果如图5所示，atwnk9基因的表达受胁迫处理强烈诱 导，其中aba的诱导效应最明显，atwnk9的转录水平在aba 处理4 h即达到峰值，为对照处理的89倍，在随后的8 h 内其表达量仍然维持较高的水平；atwnk9基因对nacl处理 的响应更快，在处理2 h达到最大值，为对照处理的89 倍左右，随处理时间延长atwnk9基因的表达量迅速下降， 但仍为对照处理的23倍；atwnk9对葡萄糖、热、冷胁迫 的响应相对较弱，分别在葡萄糖处理4 h,热、冷处理6 h 达到最大值，为对照处理的5倍

18、、3倍和6倍；atwnk9对水 处理(对照实验)几乎没有响应，说明atwnk9基因为植物胁迫反应相关基因3讨论对基因的生物信息学分析，可为预测其生物学功能提供 参考本研究首先利用生物信息学的手段对atwnk9的核昔酸 及蛋白质序列进行了保守结构域和磷酸化位点分析，发现 atwnk9基因包含与蛋白激酶催化结构域(pkc_)和丝氨酸苏 氨酸催化结构域(stykc)具有高度相似性的结构域，且存 在多个磷酸化位点，与wnk激酶家族中其他成员的结构特征 一致23,因此，atwnk9具有自身磷酸化特点，这还需作进 一步研究基因的表达部位及表达模式通常与基因的功能有紧密 的联系结合生物信息学分析、原生质体转

19、化及荧光定位分 析，得知atwnk9在细胞核中表达，说明atwnk9基因编码核 蛋白此外，根据efp browser提供的数据及实时定量pcr分 析，证明了 atwnk9基因在拟南芥根中高效表达，这与wang 等的rtpcr实验结果相吻合，说明atwnk9可能参与根的 生长发育利用plant care对atwnk9启动子顺式作用元件进行分 析，结果显示：启动子区域存在大量激素响应与胁迫响应相 关元件通过激素和胁迫处理发现,atwnk9基因的表达受aba, nacl等非生物胁迫强烈诱导，说明atwnk9为非生物胁迫反 应相关基因这为进一步研究atwnk9基因的生物学功能奠定 了良好基础参考文献1

20、张那，陈楠wnk激酶的研究进展j细胞生物学杂 志，2008 (6)：711-715zhang chong, chen nan progress in wnk kinasesj chinese journal of cell biology, 2008 (6)：711-715.(in chinese)吕晶玉wnk基因表达的研究d沈阳：中国医科大学临 床流行病学系，2003nakamichi n, murakamik0jima m, sato e, et al compilation and characterization of a novel wnk family of protein kin

21、ases in arabiodpsis thaliana with reference to circadian rhythmsj biosci biotechnol biochem, 2002,66 (11)：2429-24364wang y, liu k, liao h, et al the plant wnk gene family and regula tion of flowering time in arabidopsisj plant biol (stuttg), 2008,10 (5)：548-562zhang b, liuk, zheng y, et al disruptio

22、n of atwnk8 enhances tolerance of arabidopsis to salt and osmotic stresses via modulating proline content and activities of catalase and peroxidase j int j mol sci, 2013,14(4)：7032-7047kumar k, rao k p, biswas d k, et al rice wnk1 is regulated by abiotic stress and involved in internal circadian rhy

23、thmj plant signal behav, 2011, 6 (3)： 316-320wang y, suo h, zheng y, et al the soybean rootspecific protein kinase gmwnk1 regulates stressresponsive aba signaling on the root system architecturej plant j, 2010, 64 (2)： 230-242wang y, suo h, zhuang c, et al overexpression of the soybean gmwnk1 altere

24、d the sensitivity to salt and osmoticstress in arabidopsisj j plant physiol, 2011, 168 (18)： 2260-2267xiang l, guo x, niu y y, et al fulllength cdna cloning and bioinformatics analysis of pnugtl gene in panax notoginsengj yao xue xue bao, 2012, 47 (8)： 1085-109110 marcherbauer a, zheng c, chitsaz f,

25、 et al cdd： conserved domains and protein threedimensional structurej nucleic acids res, 2013, 41 (1 )： 348-35211 geerl y, domrachev m, lipman d j, et al cdart： protein homology by domain architecture j genome res, 2002, 12 (10)： 1619-1623blom n, gammeltoft s, brunak s sequence and strueturebased pr

26、ediction of eukaryotic protein phosphorylation sitesj j mol biol, 1999,294 (5)：1351-136213horton p, park k j, obayashi t,et al wolf psort: protein localization predictorj nucleic acids res , 2007 ,35 ( web server issue ):w585-w58714 heazlew00d j l, verboom r e, tontifilippini j, et al suba： the arab

27、idopsis subcellular da/tabasej nucleic acids res, 2007, 35(database issue)： d213-d21815 schmid m, davison t s, henz sr, et al a geneexpression map of arabidopsis thaliana developmentj nat genet, 2005,37 (5)：501-50616 lescot m, dehaisp, thijsg, et al plantcare,a database of plant cisacting regulatory

28、 elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences j nucleic acids res, 2002,30 (1 )：325-32717 yu f, qian l, nibau c, et al feronia receptorkinase pathway suppresses abscisic acid signaling in arabidopsis by activating abi2 phosphatasej proc natl acad sci usa, 2012,109 (36)：14693-1469818 chan z expression profiling of aba pathwaytranscripts indicates crosstalk between abiotic and biotic stress responses in arabidopsisj genomics, 2012,100 (2)：110-11519 barrer0 j m, rodriguez p l, quesada v, etal both abscisic acid ( aba ) depe