图位克隆原理.PPT

1、12在拟南芥的众多生态型中最常用的三种是 Landsberg erecta(Ler) Columbia(Col) Wassilewskija(Ws) 其中其中Col生态型用于拟南芥的全基因组测序。生态型用于拟南芥的全基因组测序。3MarkerSSLPsCAPsdCAPsInDelSNP4 SSLP= simple sequence length polymorphisms简单序列长度多态性简单序列长度多态性又称又称 SSR= simple sequence repeats 比较产物长度比较产物长度5 CAPs= cleaved amplified polymorphic sequences酶切

2、扩增多态性酶切扩增多态性利用酶切位点利用酶切位点6Marker: MIG5-BCLHC7 dCAPs= derived CAPS 设计引物引入错配碱基，从而引入酶切位点设计引物引入错配碱基，从而引入酶切位点8其它标记 InDel= insertion-deletion 插入缺失标记，指的是两插入缺失标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的位点，设计

3、一些扩增这些插入缺失位点的PCR 引物，这就是引物，这就是InDel标记。标记。 部分部分SSLP就是由就是由InDel转化而来转化而来 密度：密度： 每每 6.6kb 存在一个存在一个9SNP = single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性单核苷酸多态性 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的所引起的DNADNA序列多态性。序列多态性。SNPSNP所表现的多态性所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个单个碱基的转换或颠换碱基的转换或颠换所引起，也可由所引起，也

4、可由碱基的插入碱基的插入或缺失所致或缺失所致。但通常所说的。但通常所说的SNPSNP并不包括后两并不包括后两种情况。种情况。( (后面两种情况的多态性一般归为后面两种情况的多态性一般归为InDelInDel） 密度：密度： 每每 3.3kb 存在一个存在一个10SSLPs11粗定位引物 （更新）12粗定位引物 （混合）131415F1父本染色体父本染色体母本染色体母本染色体16F1假设：假设：Aa 突变位点突变位点Bb Marker突变为突变为 隐性突变隐性突变17F1 配子配子长根长根长根长根长根长根长根长根长根长根短根短根短根短根长根长根长根长根短根短根18F2 短根个体短根个体Col 单

5、带单带Ler单带单带Col Ler 双带双带 因为因为F2代根据表型来筛选个体时，我们人工选代根据表型来筛选个体时，我们人工选择的是择的是短根表型短根表型，选择的个体为，选择的个体为短根短根aa，即突，即突变位点变位点不可能存在交换不可能存在交换，交换率交换率= 0 其他位点其他位点可能存在交换可能存在交换，利用带型差异判断交，利用带型差异判断交换次数换次数19wild typemutant杂交杂交ColLerF1 plant图中的两个亲本不但在图中的两个亲本不但在A/aA/a位点有差异，在其他位点有差异，在其他位点也存在大量的遗传位点也存在大量的遗传差异，可以利用这些差差异，可以利用这些差异

6、设计分子标记，对染异设计分子标记，对染色体的具体区段进行标色体的具体区段进行标定。在该例子中，该染定。在该例子中，该染色体上总共确定了色体上总共确定了5 5个分个分子标记，标定了子标记，标定了5 5个不同个不同区段。区段。假设：假设：Aa 突变位点突变位点有有5个个Marker20只有左侧三种植株会选入定位群体只有左侧三种植株会选入定位群体自交自交F2 plants假设：假设：只存在单交换只存在单交换21分子标记分子标记M5M5与突变位点的遗传距离：与突变位点的遗传距离：10/1006/1004/100(20/(1002 ) 100%=10cMM5M5处发生交换的植处发生交换的植株包括三种情况

7、株包括三种情况假设：假设：统计统计100个个体个个体22分子标记分子标记M4M4与突变位点的遗传距离：与突变位点的遗传距离：6/1004/100(10/(1002 ) 100%=5cM23分子标记分子标记M3M3与突变位点的遗传距离：与突变位点的遗传距离：4/100(4/(1002 ) 100%=2cM24M4m4如何分辨来自于两个亲本的染色体？如何分辨来自于两个亲本的染色体？目前最常用的分子标记目前最常用的分子标记是利用两个亲本中同一是利用两个亲本中同一染色体区段的长度差异染色体区段的长度差异来设计的，如左图亲本来设计的，如左图亲本LerLer的的M4M4处染色体区段长处染色体区段长于亲本于

8、亲本ColCol中中m4m4染色体区染色体区段，在该差异位点两侧段，在该差异位点两侧设计引物经设计引物经PCRPCR扩增后得扩增后得到的到的PCRPCR产物就会有不同产物就会有不同长度，电泳后长度，电泳后M4M4泳动速泳动速度慢，度慢，m4m4泳动速度快，泳动速度快，因此通过电泳就可以分因此通过电泳就可以分辨来自于两个亲本的染辨来自于两个亲本的染色体区段色体区段25包含来自于包含来自于两个亲本的两个亲本的染色体片段染色体片段包含来自于包含来自于ColCol两条染两条染色体区段色体区段包含来自于包含来自于LerLer两条染色两条染色体区段体区段注意后两种情注意后两种情况反映的是来况反映的是来自于

9、两个配子自于两个配子的染色体区段的染色体区段的情况的情况26Col * * * * * * * * * 1、4、8、10、11、13、15、18、19共共9个个样品，只包含来自于亲本样品，只包含来自于亲本Col的染色体区段，的染色体区段，27Ler* * * 5、6、14共共3个样品，只包含来自于亲本个样品，只包含来自于亲本Ler的的染色体区段，也就是发生了染色体区段，也就是发生了28Col* * * * * * * 2、3、7、9、12、16、17共共7个样品，包含个样品，包含1个个来自于亲本来自于亲本Col的染色体区段以及的染色体区段以及1条来自于亲条来自于亲本本Ler的染色体区段，即发生

10、了的染色体区段，即发生了Ler29 突变位点与分子标记M的遗传距离：交换次数交换次数配子总数配子总数100%32 + 719 2100% 34 cM=303132SSLPs33SSLPs34 40.48% 20.00% 4.76%4.76%12.5%12.5%36%35步骤总结步骤总结筛选筛选 F2 代代 短根短根 移栽移栽提基因组提基因组各对引物各对引物PCR统计计算统计计算Rf缩小范围缩小范围寻找新寻找新Marker扩大群体扩大群体(筛选重组子筛选重组子)3周左右周左右36 在突变位点附近区域内绝大部分的样品跑样结果都应该为只有非重组的Col条带，即记录Rf为0，只有少数的样品存在交换，R

11、f记为1。 图中的6、12号样品即为重组子什么是重组子什么是重组子37 在筛选出6、12号两个重组子以后，假设在目标区域内寻找到新的标记引物，就不需要把所有的个体跑样，只需要跑重组子个体 例：筛选重组子的目的筛选重组子的目的RfMarker1Marker2Marker36号个体10112号个体100表格的跑样结果显示表格的跑样结果显示Marker2最接近突最接近突变位点，变位点，Marker3次之，下一步可以次之，下一步可以在在Marker2和和Marker3附近寻找新标附近寻找新标记引物记引物381. 建议使用一对位于建议使用一对位于相对确信的区域相对确信的区域内的内的 次低重组率标记次低重

12、组率标记引用来筛选引用来筛选 2. 可以根据情况可以根据情况调整调整用来筛选用来筛选 重组子的重组子的Marker 3. 要选择要选择好用好用、绝大部分一、绝大部分一次次 就能扩出来的标记引物就能扩出来的标记引物重组子筛选重组子筛选39 1.山大丁老师山大丁老师 提供的引物提供的引物 2.TAIR网上提供的常用网上提供的常用Marker 3.AMP上提供的常用上提供的常用Marker 4.TAIR网上公布的所有多态性位点资料网上公布的所有多态性位点资料引物寻找引物寻找40STEP1: 把目标区域内的Marker序列贴进TAIR网上的Seqviewer上搜索目标区域41MPK6 FP:AATCT

13、TGTAATCTGGTGCGTG42 点击目标区域点击目标区域43 STEP2: 把目标区域内的BAC名字记录下来 例如：K14A17至MRC8之间的BAC名字有 K14A17MCE21 MGD8 MTO12 MKP6 MIG5 MEB5 MBG14 MRC844 STEP3: 把目标区域内的BAC名字分次键入到AMP的Marker搜索栏4546 注意注意: 每个株系到精确定位后期可能用到数十上每个株系到精确定位后期可能用到数十上百的百的MARKER，请将自己使用、订制过的，请将自己使用、订制过的MARKER的相关资料清晰记录下来，便于的相关资料清晰记录下来，便于日后查看。日后查看。47目标区

14、域内基因搜索目标区域内基因搜索4849附加附加50 由于我们以短根为筛选突变体的指标，因此下面提到的突变的基因都应该会导致幼苗短根。 隐性突变隐性突变 突变基因：突变基因： a（短根）（短根） 正常基因：正常基因： A （长根）（长根）显性突变显性突变 突变基因：突变基因： A（短根）（短根） 正常基因：正常基因： a （长根）（长根）单基因突变单基因突变51 由于我们以短根为筛选突变体的指标，因此下面提到的突变的基因都应该会导致幼苗短根。 隐性突变隐性突变显性突变显性突变单基因突变单基因突变杂交杂交F1代代 突变体突变体 x Ler aa（短根）（短根） AA（长根）（长根）Aa（长根）（长

15、根） 突变体突变体 x Ler AA（短根）（短根） aa（长根）（长根）Aa（短根）（短根）杂交杂交F1代代52隐性突变隐性突变显性突变显性突变单基因突变单基因突变杂交杂交F2代代Aa（长根）（长根） 3 ：1AA Aa（长根）：（长根）： aa（短根）（短根）Aa（短根）（短根） 3 ：1AA Aa（短根）：（短根）： aa（长根）（长根）杂交杂交F2代代53隐性突变隐性突变显性突变显性突变单基因突变单基因突变杂交杂交F1代代 突变体突变体 x Ler aa（短根）（短根） AA（长根）（长根）Aa（长根）（长根） 突变体突变体 x Ler AA（短根）（短根） aa（长根）（长根）Aa（

16、短根）（短根） 注意事项：一般出现的突变注意事项：一般出现的突变大多数为隐性大多数为隐性突变突变，因此，因此理论上理论上F1F1代都为长根代都为长根(Aa)(Aa) ; ; 如如果不是，造成短根表型可能是果不是，造成短根表型可能是2 2种情况：种情况： （1 1）突变为隐性突变，杂交不成功，种子）突变为隐性突变，杂交不成功，种子为母本突变体自交所得（为母本突变体自交所得（aaaa），），表现为表现为F1F1代长短分离；代长短分离； （2 2）突变为显性突变，杂交）突变为显性突变，杂交F1F1代为代为AaAa（短根），杂交不成功的母本自交种为（短根），杂交不成功的母本自交种为AAAA（短根），（

17、短根），表现为表现为F1F1代全部为短根代全部为短根 注意事项注意事项2 2：由于根长还会受环境因素影响，：由于根长还会受环境因素影响，有时并不能准确判断，例如出现中根、或者对有时并不能准确判断，例如出现中根、或者对照也长得不好的情况。照也长得不好的情况。 建议处理方法：建议处理方法：分类分类后后全部移栽全部移栽，分成长根、，分成长根、中根、短根等，在盆上标明，待苗长大后（中根、短根等，在盆上标明，待苗长大后（2 2至至3 3周后）编号后单株提取基因组，用任意一周后）编号后单株提取基因组，用任意一对粗定位用的对粗定位用的SSLPSSLP引物做引物做PCRPCR，验证杂交苗验证杂交苗真假真假。

18、真的真的F1F1杂交苗为双带，假的为单带（杂交苗为双带，假的为单带（colcol带）带）54隐性突变隐性突变显性突变显性突变单基因突变单基因突变杂交杂交F2代代Aa（长根）（长根） 3 ：1AA Aa（长根）：（长根）： aa（短根）（短根）Aa（短根）（短根） 3 ：1AA Aa（短根）：（短根）： aa（长根）（长根）杂交杂交F2代代 注意事项：一般出现的突变大多数为注意事项：一般出现的突变大多数为隐性隐性突变突变，因此，因此理论上理论上F2代都为短根代都为短根(aa) 应为应为播种数的播种数的1/4。但实验上，分离是随机的，。但实验上，分离是随机的，实际情况未必是实际情况未必是3：1，但总体上也应该是，但总体上也应该是长根占大多数，短根占少数长根占大多数，短根占少数。 某些株系，萌发率特别低，因此某些株系，萌发率特别低，因此aa的种子的种子未必能全部萌发，就会使成苗的短根个体未必能全部萌发，就会使成苗的短根个体低于低于1/4。因此，统计。因此，统计F2表型时，要统计表型时，要统计播播种总数、种总数、萌发数萌发数、长根、短根长根、短根等项目，以等项目，以便分析。便分析。 注意事项注意事项2 2： 某些株系如果刚好是某些株系如果刚好是双突变双突变，则分离比会，则分离比会根根据不同情况而偏离据不同情况而偏离3 3：1 1，例如，例如1515：1 1等情况等情况 如果在