紫外可见分光光度计的简单原理说课材料

1、 技术讲座技术讲座中南大学现代中南大学现代(xindi)分析测试中心分析测试中心 邓世林邓世林第一页，共40页。 内容提要第一篇 原理及应用领域第二篇 常用(chn yn)测定方法第三篇 影响仪器质量的几个重要指标第二页，共40页。第三页，共40页。光的选择吸收光的选择吸收 当一束光照射到某种物质的固态物或溶液上时，一部分光会当一束光照射到某种物质的固态物或溶液上时，一部分光会被吸收或被反射，不同的物质对于照射它们的光束的吸收程度是被吸收或被反射，不同的物质对于照射它们的光束的吸收程度是不同的，对某个不同的，对某个(mu )(mu )波长的光吸收强烈，对另外波长的光吸波长的光吸收强烈，对另外波

2、长的光吸收很小或不吸收，我们把这种现象称为光的选择吸收。收很小或不吸收，我们把这种现象称为光的选择吸收。 物质呈现出特征的颜色，就是它们对可见光中某些特定波长物质呈现出特征的颜色，就是它们对可见光中某些特定波长的光线选择吸收的缘故。的光线选择吸收的缘故。 一切物质都会对可见和不可见光中的某些波长的光进行吸收一切物质都会对可见和不可见光中的某些波长的光进行吸收第四页，共40页。 物质物质(wzh)颜色和吸收光颜色的关系颜色和吸收光颜色的关系 吸吸 收收 光光 物质物质(wzh)颜色颜色 颜颜 色色 波波 长长(nm) 黄黄 绿绿 紫紫 400 450 黄黄 蓝蓝 450 480 橙橙 绿绿 蓝蓝

3、 480 490 红红 蓝蓝 绿绿 490 500 紫紫 红红 绿绿 500 560 紫紫 黄黄 绿绿 560 580 蓝蓝 黄黄 580 600 绿绿 蓝蓝 绿绿 600 650 蓝蓝 绿绿 红红 650 750第五页，共40页。 电磁波谱图电磁波谱图 0.01nm 0.1nm 800nm 10m 500m 1cm 波长波长 200nm 400nm 2.5m 25m 1m 光谱光谱(gungp) 可可区域区域 见见 射线射线 射线射线 紫外光紫外光 光光 红外光红外光 微波微波 无线电波无线电波 分析分析 分光分光方法方法 射线射线 光度光度 核磁共振核磁共振 射线光谱射线光谱(gungp)

4、法法 光谱光谱(gungp)法法 紫外紫外光谱光谱(gungp)法法 法法 红外光谱红外光谱(gungp)法法 微微波光谱波光谱(gungp)法法 光谱光谱(gungp)法法 1m = 104 m = 106nm = 109 第六页，共40页。 入射光入射光I0透射光透射光I 光程长光程长 光源光源透射率透射率 T =I0I检测器检测器第七页，共40页。第八页，共40页。LAMBERT-BEERLAMBERT-BEER定律定律(dngl)(dngl)此处此处T: 透射率透射率e: 摩尔消光系数摩尔消光系数l: 光程光程(un chn)长长 C: 浓度浓度 吸收吸收 A = log = e e

5、C l1T 当一束平行的单色光通过(tnggu)某一均匀溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和光程的长度的乘积成正比。第九页，共40页。A = log = - log T = e C l = abc吸光度吸光度(gungd)、透、透过过率与率与浓浓度的关系度的关系（波（波长长、吸收池光程一定）、吸收池光程一定）00.20.40.60.8100.511.522.533.54Abs%T 浓度(nngd)1T第十页，共40页。UV应用领域大学科研院所制药化学电机电力、供气光学金属医疗分析实验室其它大学科研院所制药化学电机电力、供气光学金属医疗分析实验室其它应用领域：应用领域： 涉及化学涉及化学(huxu

6、)化工、医疗卫生、冶金地质、化工、医疗卫生、冶金地质、食品饮料、农业化肥、畜牧水产、机械制造、计量科学、食品饮料、农业化肥、畜牧水产、机械制造、计量科学、环保、制药、生物、材料、石油等领域中的科研、教学、环保、制药、生物、材料、石油等领域中的科研、教学、生产中的质量控制、原材料和产品检验等各个方面，进生产中的质量控制、原材料和产品检验等各个方面，进行定性分析、定量测定、纯度检查、结构分析、络合物行定性分析、定量测定、纯度检查、结构分析、络合物组成及稳定常数测定、动力学研究等等。组成及稳定常数测定、动力学研究等等。第十一页，共40页。UV的测定范围有机化学分析无机化学分析光学测定生物化学分析环境

7、分析色彩測定临床分析有机化学分析无机化学分析光学测定生物化学分析环境分析色彩測定临床分析测定范围：测定范围： 几乎所有的无机元素和在紫外及可见光区有特征几乎所有的无机元素和在紫外及可见光区有特征(tzhng)吸收的有机物或有机化合物都能用紫外吸收的有机物或有机化合物都能用紫外/可见分可见分光光度法进行测定。光光度法进行测定。第十二页，共40页。 紫外紫外/可见分光光度计的基本可见分光光度计的基本(jbn)结构结构 光源光源 单色器单色器 样品室样品室 检测器检测器 控制放大电路控制放大电路 显示器显示器 比色皿比色皿 光电管（或光电池）光电管（或光电池） 放大器放大器 单色光单色光 显示器显示

8、器 单光束紫外单光束紫外/可见分光光度计可见分光光度计 斩光器斩光器 单色光单色光 光电管（或光电池）光电管（或光电池） 放大器放大器 反光镜反光镜 双光束紫外双光束紫外/可见分光光度计可见分光光度计第十三页，共40页。 比色皿 光电管（或光电池） 斩光器 放大器单色光 显示器 光电管（或光电池） 准双光束紫外/可见分光光度计 S1 准直(zhn zh)镜 切尼尔-特纳 G 单色器结构 S2 准直(zhn zh)镜第十四页，共40页。第二篇第二篇紫外紫外/可见分光光度可见分光光度(gungd)测测定的一般方法定的一般方法第十五页，共40页。（一）定量分析（一）定量分析一、绝对法一、绝对法 基于

9、朗伯基于朗伯-比尔定律比尔定律A = ebC ，当某一物质在一定波长下，当某一物质在一定波长下e（吸收系数，可（吸收系数，可由已知浓度样品由已知浓度样品(yngpn)通过测量、计算求得）为一常数，比色皿的光程也通过测量、计算求得）为一常数，比色皿的光程也是已知，也是一个常数，只要在吸收系数指定的波长处测定样品是已知，也是一个常数，只要在吸收系数指定的波长处测定样品(yngpn)溶溶液的吸光度值液的吸光度值(OD值值)，然后由下式求得该样品，然后由下式求得该样品(yngpn)溶液的浓度或含量：溶液的浓度或含量： C = A / e b 二、标准对照法二、标准对照法 在同样条件下，在选定的波长处，

10、分别测定已知浓度标准溶液的吸光度值在同样条件下，在选定的波长处，分别测定已知浓度标准溶液的吸光度值A标和样品标和样品(yngpn)溶液的吸光度值溶液的吸光度值A样，然后由下式求得样品样，然后由下式求得样品(yngpn)溶溶液的浓度或含量：液的浓度或含量： C样样 = A样样 A标标 C标标第十六页，共40页。三、标准曲线法（包括三、标准曲线法（包括K K因数法）因数法） 最常用的定量分析方法。即在一定波长（最常用的定量分析方法。即在一定波长（maxmax）下）下测定某物质的标准系列溶液的吸光度作校正曲线，然后测定某物质的标准系列溶液的吸光度作校正曲线，然后测定样品溶液的吸光度值，由校正曲线求得

11、样品溶液的测定样品溶液的吸光度值，由校正曲线求得样品溶液的浓度或含量。浓度或含量。 所配置的标准系列溶液的吸光度应在所配置的标准系列溶液的吸光度应在0.10.1 1.5Abs1.5Abs范范围内，吸收测定的精密度可达围内，吸收测定的精密度可达0.5%0.5%。 注意：注意：UV/VisUV/Vis的最低检测浓度与吸收系数、仪器噪的最低检测浓度与吸收系数、仪器噪声、基线平直度、光谱带宽声、基线平直度、光谱带宽(di ku(di kun)n)有关。而最高检测有关。而最高检测浓度则与吸收系数、仪器的杂散光、光谱带宽浓度则与吸收系数、仪器的杂散光、光谱带宽(di ku(di kun)n)等有关，吸收系

12、数与光谱带宽等有关，吸收系数与光谱带宽(di ku(di kun)n)有关。杂散光越有关。杂散光越小，检测上限越高。小，检测上限越高。第十七页，共40页。四、双波长法四、双波长法 标准溶液澄清透明，待测样品浑浊或含有一种与吸收峰临近的干扰标准溶液澄清透明，待测样品浑浊或含有一种与吸收峰临近的干扰成分，对待测成分主吸收波长的吸光度有叠加影响，干扰成分随待测成成分，对待测成分主吸收波长的吸光度有叠加影响，干扰成分随待测成分浓度变化或无法将干扰成分加入标准溶液中，则必须用双波长法扣除分浓度变化或无法将干扰成分加入标准溶液中，则必须用双波长法扣除这种干扰成分对待测成分吸光度读数的影响。这种干扰成分对待

13、测成分吸光度读数的影响。 双波长法是以样品溶液本身作参比，用两束单色光双波长法是以样品溶液本身作参比，用两束单色光11和和22交替照交替照射到同一样品溶液上，仪器自动射到同一样品溶液上，仪器自动(zdng)(zdng)求得吸光度差值求得吸光度差值A A，在一定范，在一定范围内围内A A与溶液浓度成正比，待测样品与标准溶液在同样条件下测定即可与溶液浓度成正比，待测样品与标准溶液在同样条件下测定即可定量。双波长法可消除样品溶液的浑浊背景、色度背景，排除临近吸收定量。双波长法可消除样品溶液的浑浊背景、色度背景，排除临近吸收峰的干扰（包括二波长法、等吸收点法和系数倍率法）。峰的干扰（包括二波长法、等吸

14、收点法和系数倍率法）。 1 2 1 1 2 1 2 2 第十八页，共40页。 如：核酸（DNA、RNA）的测定(260nm,280nm或230nm,260nm, 280nm)也是双波长或三波长测定法。五、多波长法六、多波长多组分定量法七、导数光谱法 导数光谱法由于能提高方法的灵敏度，改善方法选择性，有效的消除(xioch)基体干扰，尤其适合浑浊试样和进行多组分同时测定。八、 化学计量学光度法 人工神经网络-分光光度法 模糊聚类-偏最小二乘光度法 小波变换-偏最小二乘法九、固相光度法 固相光度法是将有色络合物吸附或萃取在固相（如树脂，泡沫塑料，结晶萘，石蜡等）离子交换树脂上，再在固相进行光度测定

15、。固相光度法是集分离、富集、测试于一体，不仅简化了试验过程，也大大提高了灵敏度和选择性。 另外，还有比吸收系数法、示差分光光度法等，因常规测定应用较少，这里不作详细讨论。第十九页，共40页。十、动力学光度法十、动力学光度法 即时间扫描方式测定。是光度计的吸光度（即时间扫描方式测定。是光度计的吸光度（Abs）、透过率（）、透过率（%T）随时间变化的一种动态测量方式。随时间变化的一种动态测量方式。 主要用于酶机理研究、酶活性测定、元素分析及化学反应机理的研主要用于酶机理研究、酶活性测定、元素分析及化学反应机理的研究等。动力学光度法因其特有的高灵敏度在光度分析中占有重要地位。究等。动力学光度法因其特

16、有的高灵敏度在光度分析中占有重要地位。动力学光度法可分为三种动力学光度法可分为三种(sn zhn)类型：（类型：（1）催化动力学光度法，）催化动力学光度法，这是最主要的也是最常用的动力学光度法，系利用被测离子催化显色体这是最主要的也是最常用的动力学光度法，系利用被测离子催化显色体系的显色反应或褪色反应进行测定，近年来，利用催化反应测定的论文系的显色反应或褪色反应进行测定，近年来，利用催化反应测定的论文呈现非常明显的上升之势。其测定范围已包括许多过渡金属、贵金属、呈现非常明显的上升之势。其测定范围已包括许多过渡金属、贵金属、非金属和无机阴离子。涉及的元素有非金属和无机阴离子。涉及的元素有Ag、A

17、l、AS、Au、Bi、Br、Ca、Cd、Ce、Co、Cr、Cu、Eu、F、Fe、Hg、I、Mn、Mo、Ni、Os、Pb、Pt、Pd、Re、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、Sr、Te、Ti、Tl、Th、U、V、Zn等。涉及的阴离子有等。涉及的阴离子有SCN-、BrO3-、NO2-、NO3-。（。（2）诱导动力学光度法，系利用某一转化反应来诱导另一转化反应，借以进诱导动力学光度法，系利用某一转化反应来诱导另一转化反应，借以进行光度测定。（行光度测定。（3）速差动力学光度法，是利用性质相近的不同离子在）速差动力学光度法，是利用性质相近的不同离子在同一显色体系中反应速率常数的差异，对其分别进行

18、光度测定。同一显色体系中反应速率常数的差异，对其分别进行光度测定。 第二十页，共40页。 ABS ABS (%T) (%T) 时间(shjin) 时间(shjin)第二十一页，共40页。（二）定性分析（二）定性分析(dngxngfnx)(dngxngfnx)一、利用标准物质定性一、利用标准物质定性 在相同条件下，用光谱扫描法测定未知物的吸收光谱，与所推断化合物的在相同条件下，用光谱扫描法测定未知物的吸收光谱，与所推断化合物的标准物的吸收光谱进行比较，如果两吸收光谱的形状和吸收峰的数目、位置、标准物的吸收光谱进行比较，如果两吸收光谱的形状和吸收峰的数目、位置、拐点等完全一致，就可初步判定未知物与

19、标准物是同一种物质。但要注意，物拐点等完全一致，就可初步判定未知物与标准物是同一种物质。但要注意，物质不同但光谱相似的特殊情况。质不同但光谱相似的特殊情况。二、用波长位置判断有机化合物的生色基团二、用波长位置判断有机化合物的生色基团 例如，若发现在例如，若发现在210210 250nm250nm有强吸收峰，则可能有双键并处在共扼状态。有强吸收峰，则可能有双键并处在共扼状态。在在260nm260nm、300nm300nm、330nm330nm有高强度的吸收带，表示有有高强度的吸收带，表示有3 3 5 5个共扼单位，如在个共扼单位，如在270270 300nm300nm之间有弱吸收之间有弱吸收(e

20、=10(e=10 100)100)，表示有羟基的存在；在，表示有羟基的存在；在250250 300nm300nm之之间有中强度吸收间有中强度吸收(e=1000 (e=1000 10000)10000)，表示有笨环存在等。，表示有笨环存在等。第二十二页，共40页。（三）纯度检查（三）纯度检查 主要用于检查对光没有特征吸收的化合物中的具有特征吸收主要用于检查对光没有特征吸收的化合物中的具有特征吸收的杂质。的杂质。 如检查乙醇中醛的量，可用蒸馏水作参比，在如检查乙醇中醛的量，可用蒸馏水作参比，在270 290 nm处测量吸光度，如在处测量吸光度，如在280nm处有吸收，表示有醛。处有吸收，表示有醛。

21、 双波长或三波长核酸（双波长或三波长核酸（DNA、RNA）的测定）的测定(cdng)时，根时，根据据A260 / A280的比值可确定的比值可确定DNA或或RNA的纯度。对于的纯度。对于DNA，比，比值为值为1.6 1.8之间之间,RNA比值为比值为1.8 2.0之间之间,认为纯度较高。认为纯度较高。 又如四氯化碳中，最主要的杂质是二硫化碳（又如四氯化碳中，最主要的杂质是二硫化碳（CS2）。二硫化）。二硫化碳杂质的多少，衡量产品质量的好坏。二硫化碳在紫外区的碳杂质的多少，衡量产品质量的好坏。二硫化碳在紫外区的318nm处有一个很强的吸收峰。因此，只要检查处有一个很强的吸收峰。因此，只要检查31

22、8nm处二硫化处二硫化碳吸收峰的大小，就可知道四氯化碳产品是否合格。碳吸收峰的大小，就可知道四氯化碳产品是否合格。第二十三页，共40页。（四）固体样品的分析（四）固体样品的分析 固体样品分析的配件主要有：积分球、镜面反射固体样品分析的配件主要有：积分球、镜面反射(fnsh)装置、固体样装置、固体样品支架、凝胶扫描装置及凝胶薄膜支架等。品支架、凝胶扫描装置及凝胶薄膜支架等。 积分球是利用固体样品的正反射积分球是利用固体样品的正反射(fnsh)（入射光按以法线为中心的（入射光按以法线为中心的对称角度反射对称角度反射(fnsh)，称镜面反射，称镜面反射(fnsh)）或漫反射）或漫反射(fnsh)（入

23、射光（入射光向各方向反射向各方向反射(fnsh)）的特性进行分析的装置。）的特性进行分析的装置。 镜面反射镜面反射(fnsh)装置主要用于半导体、光学材料的反射装置主要用于半导体、光学材料的反射(fnsh)率率测试。测试。 固体样品支架、凝胶扫描装置及凝胶薄膜支架用于光学玻璃、电泳胶固体样品支架、凝胶扫描装置及凝胶薄膜支架用于光学玻璃、电泳胶条等的测定。条等的测定。 积分球、镜面反射积分球、镜面反射(fnsh)装置是利用光的反射装置是利用光的反射(fnsh)原理进行定原理进行定性、定量测定。如配备有透射样品池架，也可进行样品溶液的透射测定。性、定量测定。如配备有透射样品池架，也可进行样品溶液的

24、透射测定。如配备大内径积分球（如配备大内径积分球（150mm）可测定粉状、纸、布料及溶液等样品的）可测定粉状、纸、布料及溶液等样品的反射反射(fnsh)透射光谱，同时最适合于色彩分析。透射光谱，同时最适合于色彩分析。参比光束参比光束 I0 倒置型倒置型 标准白板标准白板 光电倍增管光电倍增管 样品样品样品光束样品光束 积分球示意图积分球示意图第二十四页，共40页。（五）结构（五）结构(jigu)分析分析 紫外紫外/可见分光光度计可用来判别物质的异构体，如可见分光光度计可用来判别物质的异构体，如互变异构体、顺反异构体等。互变异构体、顺反异构体等。第二十五页，共40页。第三篇影响紫外仪器质量的几个

25、(j )重要指标第二十六页，共40页。一、光度准确度与重复性一、光度准确度与重复性定义：多次测量平均值与真值之差为光度准确度（定义：多次测量平均值与真值之差为光度准确度（T 、 A）；最大值）；最大值与最小值之差为光度重复性。偏差越小，准确度越高。光度准确度和光与最小值之差为光度重复性。偏差越小，准确度越高。光度准确度和光度重复性是非常重要的技术指标，直接关系到测试结果的准确性。度重复性是非常重要的技术指标，直接关系到测试结果的准确性。 光度准确度在不同的吸光度范围是不同的，因此光度准确度的表示光度准确度在不同的吸光度范围是不同的，因此光度准确度的表示一定要指出在多少吸光度或在多少透射比情况下

26、测试的。一定要指出在多少吸光度或在多少透射比情况下测试的。影响光度准确度的主要因素有：影响光度准确度的主要因素有： 仪器的杂散光大小。仪器的杂散光大小。 仪器的光谱仪器的光谱(gungp)带宽带宽 仪器的光度噪声仪器的光度噪声 试样的制备试样的制备 仪器的基线平直度仪器的基线平直度 比色皿的性能比色皿的性能 光度准确度的检查光度准确度的检查: 一般用标准滤色片或的重铬酸钾的一般用标准滤色片或的重铬酸钾的0.005mol/L H2SO4溶液。溶液。酸性重铬酸钾溶液的标准吸收值如下：酸性重铬酸钾溶液的标准吸收值如下： 吸吸 光光 度度 测量波长测量波长(nm) 溶液溶液A (50mg/L K2Cr

27、2O7) 溶液溶液B (100mg/L K2Cr2O7) 235（谷）（谷） 0.626 0.09 1.251 0.019 257（峰）（峰） 0.727 0.007 1.454 0.015 313（谷）（谷） 0.244 0.004 0.488 0.007 350（峰）（峰） 0.536 0.005 1.071 0.011第二十七页，共40页。图1 透光度误差T与吸光度相对误差A/A0和吸光度真值A0的关系图1 透光度误差T与吸光度相对误差A/A0和吸光度真值A0的关系0.000.010.020.030.040.050.060.070.080.090.102.42.22.01.81.61.4

28、1.21.00.80.60.40.20.0A0A/A0-0.005T-0.004T-0.003T-0.002T-0.001T-0.0005T第二十八页，共40页。二、杂散光二、杂散光定义：单色器额定通带以外的透射辐射能量与总的透射能量之比，定义：单色器额定通带以外的透射辐射能量与总的透射能量之比，也就是光谱通带以外也就是光谱通带以外“不要的不要的”光通量就是杂散光。光通量就是杂散光。 杂散光是一个非常杂散光是一个非常(fichng)重要的关键技术指标，它是紫外重要的关键技术指标，它是紫外/可见分光光度计分析误差的主要来源，直接限制被分析测试样品可见分光光度计分析误差的主要来源，直接限制被分析测

29、试样品的上限。当仪器的杂散光一定时，被分析样品的浓度越大，其分的上限。当仪器的杂散光一定时，被分析样品的浓度越大，其分析误差就越大。析误差就越大。 杂散光的主要来源：杂散光的主要来源： 1、灰尘沾污光学元件。、灰尘沾污光学元件。 2、光学元件被损伤。、光学元件被损伤。 3、准直系统内部或有关隔板边缘的反射。、准直系统内部或有关隔板边缘的反射。 4、光学系统屏蔽不好。、光学系统屏蔽不好。 5、热辐射或荧光引起的二次电子反射。、热辐射或荧光引起的二次电子反射。 6、狭逢的缺陷。、狭逢的缺陷。 7、光学系统的像差。、光学系统的像差。、 8、单色器内壁黑化处理不当。、单色器内壁黑化处理不当。 光栅是杂

30、散光的主要来源，占总杂散光的光栅是杂散光的主要来源，占总杂散光的80%。测定方法：一般采用标准滤光片或测定方法：一般采用标准滤光片或10g/L的的NaI及及NaNO3水溶液。水溶液。在紫外区测定在紫外区测定220nm(NaI)或或340nm(NaNO3)处的透过率处的透过率%T ，在，在可见光区用可见光区用384mg/L的的KMnO4 ，测定，测定525nm处的透过率处的透过率%T 。第二十九页，共40页。图1 杂 散光S 与吸光度 相对误差A / A 0 和吸光度真值A 0 的关 系0.000.010.020.030.040.053.43.23.02.82.62.42.22.01.81.61

31、.41.21.00.80.60.40.20.0A0A /A00.005S0.004S0.003S0.002S0.001S0.0005S0.0004S0.0003S0.0002S0.00015S0.0001S0.00005S第三十页，共40页。第三十一页，共40页。 不同程度不同程度(chngd)杂散光对比尔定律的杂散光对比尔定律的偏离偏离0.1%T第三十二页，共40页。三、噪声三、噪声定义：定义： 无样品时仪器自身的波动。无样品时仪器自身的波动。 也就是说：噪声是叠加在待测量的分析信号中不需要也就是说：噪声是叠加在待测量的分析信号中不需要的信号，即零信号上下波动的振幅宽度。的信号，即零信号上下波动的振幅宽度。重要性：重要性： 光度噪声影响光度测量的灵敏度（信噪比）、精密度光度噪声影响光度测量的灵敏度（信噪比）、精密度和准确度。限制测定和准确度。限制测定(cdng)浓度的下限，是分析误差的浓度的下限，是分析误差的主要来源。主要来源