浓缩胶和分离胶

1、浓缩胶和分离胶的PH 值不同， 前者主要表现为浓缩效用，后者表现为电荷效用和分子筛效用。浓缩效应主要在浓缩胶中完成，浓缩胶的pH6.8 ，在这个 pH 条件下，缓冲液中的HCl 的 Cl 离子几乎全部解离， Gly 的等电点为6.0 ，仅少数解离为负离子，在电场中移动速度很慢。酸性蛋白质在此pH 下解离为负离子， 三类离子的迁移速率为Cl> 一般蛋白质 >Gly ，电泳开始后， Cl 离子泳动快，在其后留下一个低离子浓度区。Gly 在电场中移动很慢，造成移动离子的缺乏， 于是快慢离子间就形成了一个缺少离子的高压区，在高压区内所有的负离子都会加速移动，当移到Cl 离子区域时，高电压消

2、失，蛋白质的移动速度慢下来，当以上稳定状态建立后， 蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一个狭小的之间层，并按蛋白质所带负电荷量的多少依次排列成带，浓缩样品，从浓缩胶进入分离胶后，胶的pH 升高， Gly 的离解度增大，泳动率上升，又因为它分子小，故超过所有的蛋白质分子，紧跟在Cl 离子后，Cl 离子迁移后，低离子浓度不再存在，形成了恒定的电场强度，因此，蛋白质样品在分离胶中的分离主要取决于它的电荷性质，分子大小和形状， 分离胶的孔径有一定大小， 对不同相对质量的蛋白质来说，通过时收到的滞阻作用不同， 即使静电荷相等的颗粒， 也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。10和 12胶的差

3、别：根据你目的蛋白分子量而定， 如果说是分子量较大的蛋白 （ 60KD以上），可以用 10的胶，分子量在 60 30KD之间的可以用 12的胶，低于 30KD的我一般都是用 15的胶了。 主要在于指示线刚好跑出胶底的时候，你的目的蛋白能够恰好处于胶的中间部分。凝胶的浓度大小不同所对应的凝胶孔径大小也不同，浓度小的孔径大，浓度大的孔径小，一般分离胶用12%的，浓缩胶用5%的，因为浓缩胶的目的就是将所有的蛋白浓缩在同一起跑线上，然后一块进入分离胶分离。据蛋白大小定。Western Blot转膜在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、 DBM、 D

4、DT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯） ，其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P（ 0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。A 半干法即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。1 实验条件的选择电流 1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间具体可以根据实际适当调整。目的蛋白分子大小(kDa)胶浓度转

5、移时间80-140 8% 1.5-2.025-80 10% 1.515 40 12% 0.75<2015% 0.52 实验操作（1）滤纸和膜的准备( 在电泳结束前20 分钟应开始准备工作) 。A. 检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。B. 检查是否有合适大小的滤纸和膜。C. 将膜泡入甲醇中，约1-2 分钟。再转入transfer buffer中。D. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer中。PDVF膜在进转移缓冲液时，要在甲醇里面泡多长时间?PVDF是疏水性的， 在转膜缓冲液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润。PVDF 的预处理是用甲

6、醇浸泡活化，浸泡透之后转入蒸馏水洗两次。用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合。一般 5-20 分钟都有人在用。可在取胶的同时泡，估计前后5 分钟左右。效果还不错。以前有站友发贴，说处理时间没多大关系，关键看膜的质量确实是这样的。只要让膜完全浸透应该就没问题了。Hybond 的 PVDF说明书这样的写的：“ pre-wet the membrane in 100% methanol (10seconds) ”。我的理解是，至少10 秒钟，多泡下也没关系的，事实上，泡10 秒的做过，10 分钟的也做过，都没有问题的。（2）转移A. 在电转移仪上铺好下层滤

7、纸。一般用三层。B. 将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的湿润。C. 将胶剥出，去掉stack gel，小心的移到膜上。D. 剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。E. 将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。倒上些 transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸。F. 装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。G. 转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。3 注意事项及常遇到的问题：1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。3）因为膜的疏水性，膜必须

8、首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。5）转移时间一般为1.5小时， ( 1mA-2mA/cm2 ， 10% gel) ，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。1) 在叠膜、胶、纸三明治时候，操作于盛有转膜 Buffer 的大平皿中进行，叠好后，再将三者平行转移至转膜装置， 切勿再移动， 因为在 buffer 中操作， 已经完全排除了气泡存在的可能，无需再赶气泡2) 关于转膜时间：半干转的话，20 V×30min即可B 湿法我们基本上不用此方法，这里暂不做介绍。C 转移后效果的鉴定1染胶用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。2染膜有两类染液选择，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red 、 FastgreenFC、 CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉