二十一常用分子生物学技术原理及应用

1、会计学1二十一常用分子生物学技术原理及应用二十一常用分子生物学技术原理及应用n核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在在DNA复性过程中，如果把复性过程中，如果把不同不同DNA单链分子放在同一溶液单链分子放在同一溶液中，或把中，或把DNA与与RNA放在一起，放在一起，只要在只要在DNA或或RNA的单链分子之的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹技术的一、分子杂交与印迹技术的原理原理第1页/共76页复复性性RNA

2、DNA第2页/共76页（一）印迹技术（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。 第3页/共76页用放射性核素、生物素或荧光用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为的多聚核苷酸链被称为“探针探针”，探针可以与固定在探针可以与固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。子存在。 （二）探针技术第4页/共76页二、印迹技术的类别及二、印迹技术的类

3、别及应用应用（一）（一）DNA印迹印迹 (Southern Blotting)（二）（二）RNA印迹印迹 (Northern Blotting)（三）蛋白质的印迹（三）蛋白质的印迹 (Western Blotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 用于RNA的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。第5页/共76页n其他：其他：斑点印迹斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交原位杂交 (in situ hybridization)DNA点阵点阵 (DNA array) DNA芯片技术芯片技术 (DNA chip)第6页/共76页三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较

4、第7页/共76页分子杂交实验第8页/共76页放放射射自自显显影影照照片片第9页/共76页DNA点阵第10页/共76页第二节第二节聚合酶链反应聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction第11页/共76页5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、PCR技术的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 第12页/共76页Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量可以扩大的含量可以扩大100万倍万倍以上。以上。第13页/共7

5、6页 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+n PCR体系基本组成成分第14页/共76页n PCR的基本反应步骤变性95C延伸72C退火Tm-5C第15页/共76页利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。 二、PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆第16页/共76页利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。 PCR技术高度敏

6、感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。 （三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突变第17页/共76页将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性 。（四）DNA序列测定（五）基因突变分析第18页/共76页（一）逆转录PCR技术三、几种重要的PCR衍生技术第19页/共76页（二）原位PCR技术第20页/共76页（三）实时PCR技术实时实时PCR(real-time PCR)技技术通过动态监测反应过程中的产术通过动态监测反应

7、过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量析的干扰，亦被称为定量PCR。 第21页/共76页n实时实时PCR技术原理技术原理QR3355上游上游引物引物下下游游引引物物荧光标记荧光标记引物引物RQ 3355第22页/共76页第三节第三节核酸序列分析核酸序列分析Nucleic Acid Sequence Analysis第23页/共76页n核酸序列分析的基本原理：核酸序列分析的基本原理： 化学裂解法化学裂解法 (Maxam-Gillbert法法) DNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法 (Sanger法法)第24页/共76页一、一、DNA链末端合

8、成终链末端合成终止法止法第25页/共76页GATC 测序测序反应反应 电泳电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5 3 正极正极负极负极ddGddAddTddCn链末端合成终止法测定DNA序列的原理第26页/共76页二、二、DNA自动测自动测序序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定D

9、NA碱基的排列顺序。 第27页/共76页ddGddAddTddC红红色色荧荧光光绿绿色色荧荧光光黄黄色色荧荧光光蓝蓝色色荧荧光光电泳电泳DNA序列自动分析原理及结果图第28页/共76页第四节基因文库基因文库Gene Library第29页/共76页 基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) n基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。第30页/共76页一、基因组一、基因组DNA文文库库基因组基因组DNADNA文库是指生物的文库是指生物的基基因组因组DNA的信息（包括所有的编码的信息（包括所

10、有的编码区和非编码区）以区和非编码区）以DNA片段形式贮片段形式贮存的克隆群体。存的克隆群体。 用于构建基因组文库的载体用于构建基因组文库的载体有有 噬菌体、粘粒和酵母人工染色噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。体等。第31页/共76页n基因组文库和cDNA文库的构建和筛选第32页/共76页第一轮筛选第一轮筛选第二轮筛选第二轮筛选第三轮筛选第三轮筛选n基因组文库筛选结果举例第33页/共76页cDNA文库是包含某一组织细文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部胞在一定条件下所表达的全部mRNAmRNA经逆转录而合成的经逆转录而合成的cDNA序序列列的克隆群体，它以的克隆群体，它以cDNA片段的

11、片段的形式贮存着该组织细胞的基因表形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。达信息。 二、二、cDNA文库文库第34页/共76页第五节生物芯片技术生物芯片技术Biological Chip Technique第35页/共76页是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段有片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较每一位点的荧光信号做出检测、比较和分

12、析，从而迅速得出定性和定量的和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作结果。该技术亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。 一、基因芯片n基因芯片(gene chip)第36页/共76页n基因芯片工作流程示意图第37页/共76页是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应蛋白质分子间的亲和反应n蛋白质芯片(protein chip)n蛋白质芯片作用原理第38页/共76页第六节生物大分子相互作用研生物大分子相互作用研究技术

13、究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study第39页/共76页一、蛋白质相互作用研究技术 酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术第40页/共76页标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。 第41页/共76页标签融合蛋白沉淀实

14、验流程示意图第42页/共76页（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途第43页/共76页n酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。以相互作用的生物信息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为基因融合成为“诱饵诱饵”表达质表达质粒，可以筛选粒，可以筛选AD基因融合的基因融合的“猎猎物物”基因表达文库，筛选未知的相基因表达文库，筛选未知

15、的相互作用蛋白质。互作用蛋白质。第44页/共76页电 泳 迁 移 率 变 动 测 定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定第45页/共76页放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核

16、蛋白提取物1X10X 10X未标记探针未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图第46页/共76页染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法第47页/共76页n染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图第48页/共76页遗传修饰动物模型的建遗传修饰动物模型的建立及应用立及应用The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 第七节第七节第49页/共76页n转基因技术转基因技术采用基因转

17、移技术使目的基因采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。育成个体。 转基因被导入的目的基因转基因动物(transgenic animal)目的基因的受体动物一、转基因技术第50页/共76页第51页/共76页二、核转移技术第52页/共76页n基因剔除技术基因剔除技术( (gene knock out) 也称也称基因靶向基因靶向( (gene targeting) )灭活，有目的去除动灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。物体内某种基因的技术。三、基因剔除技术第53页/共76页将灭

18、活的基因放入胚胎干细将灭活的基因放入胚胎干细胞胞(embryonic stem cell，ES)中，中，使这一灭活基因通过同源重组取代使这一灭活基因通过同源重组取代原有的目的基因，筛选到基因已定原有的目的基因，筛选到基因已定点灭活的细胞后，通过显微注射将点灭活的细胞后，通过显微注射将细胞注入小鼠囊胚中。细胞在小鼠细胞注入小鼠囊胚中。细胞在小鼠囊胚中参与胚胎的发育，最终形成囊胚中参与胚胎的发育，最终形成嵌合体小鼠。嵌合体小鼠。 n操作方式操作方式第54页/共76页四、基因转移和基因剔四、基因转移和基因剔除在医学发展中的作用除在医学发展中的作用第55页/共76页第八节疾病相关基因的克隆疾病相关基因

19、的克隆与鉴定与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes第56页/共76页 功能克隆功能克隆(functional cloning) 定位克隆定位克隆(positional cloning)n克隆疾病相关基因的策略第57页/共76页n定义定义 从对一种致病基因的功能从对一种致病基因的功能的了解出发来克隆该致病基因。的了解出发来克隆该致病基因。（一）功能克隆（一）功能克隆n应用应用 生化机制已明确、基因表达生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。疾病。第58页/共76页利用酵母系统从功

20、能学角度鉴定利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。致病基因。用不同人的用不同人的DNADNA片段转化与人类片段转化与人类遗传疾病具有类似表型的突变酵母，遗传疾病具有类似表型的突变酵母，可以恢复可以恢复( (rescue)正常表型的片段正常表型的片段中所中所含有的基因含有的基因即可能为致病基因。这种即可能为致病基因。这种实验称为实验称为功能互补试验功能互补试验 (functional complementation assay)。第59页/共76页（二）定位克隆（二）定位克隆n定义定义从一种致病基因的染色体定位从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基出发逐步缩小范围，最后克隆该基

21、因。因。n系统的定位克隆工作系统的定位克隆工作 遗传学分析遗传学分析( (确定致病基因染确定致病基因染色体定位色体定位) )交换分析、连锁不平衡分交换分析、连锁不平衡分析析 分子生物学分析分子生物学分析染色体异常染色体异常( (缺失、易位缺失、易位等等) )分析、基因文库的筛选与分析、基因文库的筛选与基因克隆基因克隆第60页/共76页基因诊断和基因治疗第九节Gene Diagnosis and Gene Therapy第61页/共76页n定义直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。一、基因诊断一、基因诊断(Gene Diagnosis)n特点特点以基因作为检查材料和探察

22、目标，属于“病因诊断”。针对特定基因，特异性强。所用技术具有放大效应，故诊断灵敏度高。适用性强，诊断范围广。第62页/共76页1. DNA序列分析用于基因突变类型已经明确的遗传病的诊断及产前诊断 。2. PCR技术 快速检出样品中的痕量病原微生物。 微量DNA 样品中的基因及基因变异分析。 用于个体识别、亲缘关系鉴定、器官移植术前组织配型、基因连锁分析等等。 第63页/共76页 样品中痕量病原微生物的迅速检出、分类及分型。 同时分析样品中可能存在的多种不同基因变异方式。 分析样品中耐药菌株的存在和个体对药物或毒物的敏感性。 分析个体的疾病易感状态，如肿瘤、自身免疫病发生的预警。3. 基因芯片(

23、gene chip)第64页/共76页 将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用,以治疗疾病的方法，称为基因治疗。二、基因治疗二、基因治疗( (Gene Therapy)n定义定义第65页/共76页（一）基因治疗的基本策略1. 缺陷基因精确的原位修复基因增补基因失活基因疫苗 基因矫正基因置换第66页/共76页（二）基因治疗的基本（二）基因治疗的基本程序程序治疗性基因的选择治疗性基因的选择基因载体的选择基因载体的选择靶细胞的选靶细胞的选择择基因转移基因转移病毒载体病毒载体非病毒载体非病毒载体体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞间接体内疗法间接体内疗法直接体内疗法直接体内疗法第67页/共76页n核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在在DNA复性过程中，如果把复性过程中，如果把不同不同DNA单链分子放在同一溶液单链分子放在同一溶液中，或把中，或把DNA与与RNA放在一起，放在一起，只要在只要在DNA或或RNA的单链分子之的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹技术的一、分子杂交与印迹技术的原理原理第68页/共76页（一）印迹技术（一）印迹技术利用各种物