葡萄糖微生物限度检查法分析方法验证

1、葡萄糖微生物限度检查法分析方法验证目录a、验证方案1概述2. 适用范围3. 验证目的4. 验证小组及职责分工4. 1验证小组4. 2职责分工5. 验证内容6. 漏项与偏差及采取的纠偏牯施.7. 验证结论8. 验证方案批准b、验证报告1. 概述2. 适用范围3. 验证目的4. 验证小组及职责分工4. 1验证小组4. 2职责分工5. 确证内容6. 漏项与偏差及采取的纠偏措施.7. 验证结论8. 最终批准9.再验证周期1概述由于某些供试品抗菌活性，在建立测定方法或原测定法的检验条件发生改变时，町能影 响检验结果的准确性，必须対供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性、重现性进行验证。 验证时，按供试液的制

2、备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法进行。对各试验菌的回 收率应逐一进行验证。2适用范围适用于进厂的原辅料葡萄糖微工物限度检查平皿法的验证。3验证廿的建立葡萄糖微41物限度分析方法，包括细菌数、爲菌数及酵母菌数的检查以及控制菌的 检查，并对分析方法进行验证，以证明所采用的方法适合于葡萄糖微生物限度的检查，为 日常的检测工作提供依据。4验证小组及职责分工5验证内容5.1品种：匍萄糖原料5. 2验证方法：微生物限度检杳平iiil法5.3平皿计数方法的验证5. 3. 1培养基及稀释液5. 3. 1. 1培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基。5. 3. 1.2稀释液0. 9%

3、氯化钠溶液、ph7. 0的无菌氯化钠-蛋白豚缓冲液。5. 3. 2培养基的配制和灭菌将改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基按照购买厂家的使用说 明书进行配制，在适宜的温度条件下灭菌冷却后备用。5. 3.3试验用具将试验所用的培养皿用不锈钢培养皿消毒桶盛放，其他所需用具和溶液用牛皮纸包好, 在121°c的温度条件下灭菌20分钟冷却后备用。5. 3. 4验证试验用菌种验证试验用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为笫0 代)，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。大肠埃希菌(escherichia coli) (cmcc(b) 4

4、4 102)金黄色衙萄球菌(staphylococcus aureus) (cmcc(b) 26 003)枯草芽他杆菌(bac i 1 i us subtil is) (cmcc(b) 63 501)白色念珠菌(candida albicans) (cmcc(f)98 001)黑曲w(aspergillus niger) (cmcc(f)98 003)5. 3. 5菌液制备：取经32. 5°c培养1824小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽砲杆菌营养肉汤 液体培养物，用0. 9%无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为50loocfu的菌悬液。取经25. 5°c培养2448小

5、时的白色念珠菌改良马丁培养物，用0. 9%无菌氯化钠溶液制 成每lml含菌数为50loocfu的菌悬液。取经25. 5°c培养57天的黑1111霉改良马丁斜而培养物，加0. 9%无菌氯化钠溶液3 5ml,将砲子洗脱。然后，吸出抱子悬液至无菌试管内，用9ml 0. 9%无菌氯化钠溶液制成 每lml含50loocfu的他子悬液。5. 3. 6活菌计数活菌计数结果见下表活菌计数(cfu/ml)5. 3. 7供试液制备取葡萄糖10g,加入ph7.0的无菌氯化钠-蛋白月东缓冲液至100讯溶解，混匀，作为 1:10的供试液。5. 3. 8验证方法a试验组用吸管分别取上述1:10供试液lml和含试

6、验菌50loocfu的大肠埃希菌、金黄色葡萄 球菌、枯草芽他杆菌、口色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，每种试验菌平行测定两份。前3种 菌加入平皿中并加入营养琼脂培养基，后2种菌加入平川l中并加入玫瑰红钠琼脂培养基。b菌液组(测定所加的试验菌数)取和试验组一样多的试验菌加入平血后培养。c供试品对照组取和试验组一样稀释级别的供试液lml,加入平血中，平行操作4份，2份加入营养琼 脂培养基并培养，另2份加入玫瑰红钠琼脂培养基并培养。d稀释剂对照组用吸管分别取稀释液1ml和含试验菌50loocfu的人肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯 草芽他杆菌、门色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，置平皿中，每种试验菌平行测定两份。前3

7、种菌加入平皿中并并加入营养琼脂培养基，后2种菌加入平皿中并加入玫瑰红钠琼脂培养 基。e阴性对照用吸管分别取ph7. 0的无菌氯化钠-蛋白豚缓冲液51巻平皿中，分别加入营养琼脂培 养基和玫塊红钠琼脂培养基并培养。5. 3. 9培养及计数独立平行操作3份。分别将玫瑰红钠琼脂培养基在25.5°c培养72小时，逐h计数，以 72小时的菌落数报告,营养琼脂培养基在32. 5°c培养48小时逐日计数，以48小时的菌 落数报告。5. 3. 10试验结果试验组菌落计数(cfu/ml )实验次数1 2 3平均菌落数大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽他杆菌口色念珠菌黑曲霉菌液组菌落计数(cfu/m

8、l)实验次数1 2 3平均菌落数大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽砲杆菌白色念珠菌黑曲霉供试品对照组菌落计数(cfu/ml)实验次数1 2 3平均菌落数人肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽泡杆菌白色念珠菌黑曲霉稀释剂对照组菌-落计数(cfu/ml)实验次数1 2 3平均菌落数人肠埃希菌金黄色衙萄球菌枯草芽泡杆菌白色念珠菌黑曲霉试验组的回收率(%)=试验组平均菌落数一供试液对照组平均菌落数菌液纽平均菌落数x100%稀释剂对照组平均菌落稀释剂对照组的回收率(%)=数x100%菌液组平均菌落数试验纽的回收率(%)实验次数1 2 3平均冋收率人肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽泡杆菌白色念珠菌黑曲得稀释剂对照组的回收

9、率(%)实验次数1 2 3平均冋收率人肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孑包杆菌白色念珠菌黑曲爲5.4控制菌检杳验证5. 4. 1培养基及稀释液5. 4. 1. 1培养基营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养 肉汤培养基。5. 4. 1.2稀释液0. 9%氯化钠溶液、pii7. 0的无菌氯化钠-蛋白月东缓冲液5. 4.2验证试验用菌种金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus ) cmcc(b)26003大肠埃希菌(escherichia coli) cmcc(b) 441025. 4. 3试验步骤5.4. 3. 1培养基的配制和灭菌将营养琼脂培

10、养基、胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营 养肉汤培养基按照购买厂家的使用说明书进行配制，在121°c的条件下灭菌20n)in冷却后 备用。5. 4. 3. 2试验用具将试验所用的培养皿用不锈钢培养皿消毒桶盛放，氏他所需用具和溶液用牛皮纸包好， 在121°c的温度条件下灭菌20分钟冷却后备用。5. 4. 3. 3菌液制备取经36°c培养1824小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌营养肉汤液体培养物lml, 用0. 9%无菌氯化钠溶液稀释制成每lml含菌数为10loocfu的菌悬液。5. 4. 3. 4供试液的制备见5. 3.6供试液的制备。5.

11、4. 3. 5活菌计数活菌计数结果见下表活菌计数(cfu/ml)5. 4. 3. 6验证方法a.试验组分别取上述5. 3.6中1： 10供试液10ml和含试验菌大肠埃希菌的菌悬液10loocfu, 置于盛放有100ml胆盐乳糖培养基中。b. 阴性対照组分别取上述5.3.6 + 1： 10供试液10ml和含试验菌金黄色葡萄球菌的菌悬液lml 10 loocfu,置于100ml的胆盐乳糖培养基中。c. 阴性对照取ph7.0的无菌氯化钠-蛋白豚缓冲液10ml,置于100ml的胆盐乳糖培养基中。d.供试 品的测试取上述5.3.6中1： 10供试液10ml,置于looiiil的胆盐乳糖培养基中。5. 5

12、培养及计 数将胆盐乳糖培养基放入培养箱中，在36±1°c培养1824小时，必要时延长至48小时 计数。5.6合格标准 计算供试品组的菌回收率、稀释剂对照组的菌凹收率a、在3次独立的 平行试验屮，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数 的百分率）应均不低于70%. b、若试验组的菌冋收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照 纟i的平均菌落数的值占菌液纽的平均菌落数的百分率）均不低于70%,按此该供试液制备方 法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数.c、若任一次试验中试验组的菌回收率低 于70%,应采重新验证。阴性対照组不得检出阴性対照菌。若试验

13、组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检 查法作该供试品的控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应消除供试詁的抑菌活性。建立 新的方法，并垂新验证。5. 7验证结果分析与评价稀禅剂对照组菌回收率分别为均不低于70%；试验组菌的回收率分别为均不低于70%, 表明徊萄糖原料无抑菌成分。可按供试液制备方法和平川1法测定葡萄糖原料的细菌、需菌 和酵母菌数；在控制菌的验证屮分别川人肠埃希菌、金黄色葡萄球菌两种菌种进行了验证，阴性菌对 昭八、组阴性対照菌，试验组检出试验菌，阴性对照无菌生长，供试詁。计数方法准确和控 制菌方法专属性强，能满足葡萄糖微生物限度检查的需要，此分析方法可行。在以后的微 生物限度检测中

14、，检验人员按照验证的分析方法进行葡萄糖微生物限度检查。6.漏项与偏差及采取的纠偏措施在验证过程中，若出现漏项或偏差，立即向验证领导小组报告，征得同惠后，将漏项或 偏差部分采取的冇关措施详细阐明。结论：检查人：复核人：年 月曰7验证结论评价人：年刀日8再验证8. 1修订检验方法后；&2供试品组分发生改变町能影响检验结果时；&3原检验条件发生改变町能影响检验结果时；& 4定期的方法验证：每年一次。9验证合格证书1概述由于某些供试品抗菌活性，在建立测定方法或原测定法的检验条件发生改变时，町能影 响检验结果的准确性，必须対供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性、重现性进行验证。 验

15、证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法进行。对各试验菌的回 收率应逐一进行验证。2适用范围适用于进厂的原辅料葡萄糖微生物限度检查平皿法的验证。3验证冃的建立葡萄糖微物限度分析方法，包括细菌数、霉菌数及酵母菌数的检查以及控制菌的 检查，并对分析方法进行验证，以证明所采用的方法适合于葡萄糖微生物限度的检查，为 日常的检测工作提供依据。4验证小组及职责分丁5验证内容5.1品种：匍萄糖原料5. 2验证方法：微生物限度检査平川l法5. 3平皿计数方法的验证5. 3. 1培养基及稀释液5. 3. 1. 1培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基。5. 3. 1.2稀釋

16、液0. 9%氯化钠溶液、ph7. 0的无菌氯化钠-蛋白腺缓冲液。5. 3.2培养基的配制和灭菌将改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基按照购买厂家的使用说 明书进行配制，在适宜的温度条件下灭菌冷却后备用。5. 3. 3试验用具将试验所用的培养皿用不锈钢培养皿消毒桶盛放，其他所需用具和溶液用牛皮纸包好, 在121°c的温度条件下灭菌20分钟冷却后备用。5. 3. 4验证试验用菌种验证试验用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为笫0 代)，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。大肠埃希菌(escherichia coli) (cmc

17、c(b) 44 102)金黄色衙萄球菌(staphylococcus aureus) (cmcc(b) 26 003)枯草芽他杆菌(bac i 1 i us subtil is) (cmcc(b) 63 501)白色念珠菌(candida albicans) (cmcc(f) 98 001)黑曲霉(aspergillus niger) (cmcc(f)98 003)5. 3. 5菌液制备:取经32. 5°c培养1824小时的大肠埃希菌、金黄色匍萄球菌与枯草芽砲杆菌营养肉汤 液体培养物，用0. 9%无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为50loocfu的菌悬液。取经25. 5°c

18、培养2448小时的白色念珠菌改良马丁培养物，用0. 9%无菌氯化钠溶液制 成每lml含菌数为50loocfu的菌悬液。取经25. 5°c培养57天的黑曲爲改良马丁斜面培养物，加0. 9%无菌氯化钠溶液3 5ml,将孑包子洗脱。然后，吸出范子悬液至无菌试管内，用9ml 0. 9%无菌氯化钠溶液制成 每lml含50loocfu的抱子悬液。5. 3.6活菌计数活菌计数结果见下表活菌计数(cfu/ml)5. 3. 7供试液制备取葡萄糖10g,加入ph70的无菌氯化钠-蛋白月东缓冲液至100ml溶解,混匀，作为 1:10的供试液。5. 3. 8验证方法a试验组用吸管分别取上述1:10供试液lm

19、l和含试验菌50loocfu的大肠埃希菌、金黄色筍萄 球菌、枯草芽他杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，每种试验菌平行测定两份。前3种 菌加入平皿屮并加入营养琼脂培养基，后2种菌加入平皿小并加入玫瑰红钠琼脂培养基。b菌液组(测定所加的试验菌数)取和试验组一样多的试验歯加入平皿后培养。c供试品对照组取和试验组一样稀释级别的供试液1眉，加入平皿中，平行操作4份，2份加入营养琼 脂培养基并培养，另2份加入玫瑰红钠琼脂培养基并培养。d稀禅剂对照组用吸管分别取稀释液lml和含试验菌-50loocfu的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯 草芽泡杆菌、口色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，置平川i中，每种试验菌平行测定两份

20、。前3 种菌加入平血中并并加入营养琼脂培养棊，后2种菌加入平血中并加入玫塊红钠琼脂培养 基。e阴性对照用吸管分别取ph7. 0的无菌氯化钠-蛋白腺缓冲液lml逍平皿中，分别加入营养琼脂培 养基和玫瑰红钠琼脂培养基并培养。5. 3. 9培养及计数独立平行操作3份。分别将玫瑰红钠琼脂培养基在255°c培养72小时，逐口计数，以 72小时的菌落数报告，营养琼脂培养基在32. 5°c培养48小时逐日计数，以48小时的菌 落数报告。5. 3. 10试验结果试验组菌落计数(cfu/ml)实验次数1 2 3平均菌落数大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽砲杆菌白色念珠菌黑曲孫菌液组菌落计数(cf

21、u/ml )实验次数1 2 3平均菌落数人肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽砲杆菌口色念珠菌黑曲霍供试品対照组菌落计数(cfu/ml)实验次数1 2 3平均菌落数人肠埃希菌金黄色匍萄球菌枯草芽砲杆菌白色念珠菌黑曲霉稀释剂対照组菌落计数(cfu/ml)实验次数1 2 3平均菌落数人肠埃希菌金黄色匍萄球菌枯草芽砲杆菌门色念珠菌黑曲霉试验组的回收率(%)=试验组平均菌落数一供试液对照组平均菌落数菌液组平均菌落数x100%稀释剂对照组平均菌落稀释剂对照组的回收率(%)=数x100%菌液组平均菌落数试验组的回收率(%)实验次数1 2 3平均冋收率大肠埃希菌金黄色匍萄球菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲得稀释剂对照组

22、的冋收率(%)实验次数1 2 3平均回收率大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽砲杆菌白色念珠菌黑曲霉5. 4控制菌检査验证5. 4. 1培养基及稀禅液5. 4. 1. 1培养基营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、瞎红亚甲蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养 肉汤培养基。5. 4. 1.2稀释液0. 9%氯化钠溶液、ph7. 0的无菌氯化钠-蛋白豚缓冲液5. 4.2验证试验用菌种金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus ) cmcc(b)26003大肠埃希菌(escherichia coli) cmcc(b) 441025. 4. 3试验步骤5.4. 3. 1培养基的配制和灭菌将营养琼脂

23、培养基、胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营 养肉汤培养基按照购买厂家的使用说明书进行配制，在121°c的条件下灭菌20min冷却后 备用。5. 4. 3. 2试验用具将试验所用的培养皿用不锈钢培养皿消毒桶盛放，氏他所需用具和溶液用牛皮纸包好， 在121°c的温度条件下灭菌20分钟冷却后备用。5. 4. 3. 3菌液制备取经36°c培养1824小时的大肠埃希菌、金黄色徊萄球菌营养肉汤液体培养物lml, 用0. 9%无菌氯化钠溶液稀释制成每lml含菌数为10loocfu的菌悬液。5. 4. 3. 4供试液的制备见5. 3.6供试液的制备。5. 4. 3. 5活菌计数活菌计数结果见下表活菌计数(cfu/ml)5. 4. 3. 6验证方法a.试验组分别取上述5. 3.6中1： 10供试液10ml和含试验菌大肠埃希菌的菌悬液10loocfu, 置于盛放有100ml胆盐乳糖培养基中。b. 阴性对照组分别取上述5. 3.6中1： 10供试液10ml和含试验菌金黄色葡萄球菌的菌悬液lml 10 loocfu,置于100ml的胆盐乳糖培养基屮。c. 阴性对照取p1i7. 0的无菌氯化钠-蛋白腋缓冲液10