bFGF对兔骨髓基质细胞VEGF因子表达及细胞生物行为的影响

1、bfgf对兔骨髓基质细胞vegf因子表达及细胞生物行为的影响作者：常祺刘建胡蕴玉孟国林白建萍彭磊【关键词】血管内皮细胞生长因子effect of bfgf on vegf expression and biological behavior of marrow stromal cellsi abstract aim: to investigate the effects of basic fibroblast growth factor (bfgf) on vascular endothelial growth factor (vegf) expression and the biologic

2、al behavior of marrow stromal cells methods: the marrow stromal cells of the femur of rabbits were procured and cultured the samples were treated with different doses of bfgf and the control was not treated. five days later, the effects were observed by histopathological analysis, cells multiplicati

3、on, alkaline phosphatase activities detection, the computer analysis of bone clusters and the detection of ratio of vegfpositive cells results:there was statistically significant difference between different dose groups in all the detection items and the results of treatment groups were all better t

4、han that of the control group. conclusion: bfgf can stimulate both the multiplication and osteogenic potential of marrow stromal cells in a dose dependent manner and the best dose of bfgf is 1200 ku・ltkeywords vascular endothelial growth factor; basic fibroblast growth factor; marrow stro

5、mal cell【摘要】目的：观察兔骨髓基质细胞经bfgf刺激后，其vegf 因了表达及细胞生物行为的变化.方法：取兔双侧股骨骨髓基质细 胞，采用骨髓基质细胞体外培养技术，分别以不同剂量bfgf刺激细 胞，并设立空白对照组.培养5 d后，进行细胞形态（he染色）、增 殖情况（细胞记数法与mtt法）、碱性磷酸酶（改良钙钻法染色）、成 骨结节（图像分析）、vegf阳性细胞率（免疫组化染色）等项目的检 测.结果：不同剂量组间各项观测指标差异均显著，结果均优于空 白对照组.bfgf促进细胞增殖与vegf表达最佳剂量为1200 ku・ll结论：bfgf能促进骨髓基质细胞增殖，促进v

6、egf 的表达，其剂量与效果间存在明显相关关系.bfgf为1200 ku・l-l时，促进骨髓基质细胞表达vegf及促进细胞增殖作 用同时达到最佳效果.骨髓基质细胞0引言组织工程骨的再血管化问题一直阻碍着组织工程技术在骨科领 域的发展.血管内皮生长因子(vegf)是机体内促进血管生长最重要 的生长因子，在骨的形成及修复中也起到重要的作用，其表达水平直 接影响到以后成骨的血供，影响到成骨的速度和质量1,2骨髓 基质细胞是骨组织工程中一种常用的种子细胞，骨髓基质细胞中所包 含的许多细胞，如内皮细胞、成纤维细胞、巨嗜细胞等都可分泌表达 vegf.如何刺激骨髓基质细胞，促进vegf

7、的分泌则成为增加vegf表 达的另一重要手段.我们采用不同剂量bfgf刺激体外培养的兔骨髓 基质细胞，观察其vegf因子表达改变，并参照细胞生物行为的变化， 为临床应用提供实验依据.1材料和方法1.1材料幼兔1 wk龄，雌雄不限，由第四军医大学实验动物中 心提供.dmem培养基，胎牛血清，l谷磷酰胺，地塞米松，vit.c等 购自sigma公司，bfgf试剂购自双鹭公司，vegf mab及sp试剂盒 购自迈新公司.骨髓基质细胞原代培养：取幼兔杀死，在无菌条件下取出双侧股骨和肱骨，去除骨外膜，dmem液冲洗3次，用注射器反 复冲洗骨髓腔，冲岀的骨髓细胞接种于装有适量培养液（dmem培养 基，含10

8、0 ml・l-l胎牛血清）的培养瓶中，置于50 ml・l-l c02培养箱中37°c恒温培养,24 h后吸出悬浮细胞， 用dmem液冲洗后，留下贴壁细胞继续培养.而后隔日换液，观察细 胞生长情况.细胞融合成片，长满培养瓶底部后，用2.5 g・l-l胰蛋白酶消化，传代培养.12方法将bfgf试剂溶解于dmem中，针头滤器过滤除菌.第4 代细胞传代后，分别用含 bfgf 0, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200 和1600 ku・l-l的血清培养液培养，同时分组.取笫4代骨

9、髓基质细胞，以消化法传代后，按以上分组方法加入不同剂量bfgf 达到预期浓度，调整细胞密度至1 x107 l-1,接种于50 nil培养瓶. 置于37°c、饱和湿度、50 ml・l-l c02培养箱内培养.隔日 换液.每46 h在倒置显微镜下观察细胞形态.另取第4代细胞， 传代后调整细胞密度至1x107 l-1,接种于50 ml培养瓶（瓶中预 先置入盖玻片），培养4 d后，取出盖玻片，pbs冲洗3次，750 ml・l-1乙醇固定，行he染色（fig 1）.取第4代骨髓基质细 胞，以消化法传代后，按以上分组方法加入不同剂量bfgf,调整细 胞

10、密度至1 x107 l-1,接种于24孔培养板内，放置于培养箱内，隔 日换液.细胞培养5 d后以胰蛋白酶消化，用细胞记数板记数细胞, 每孔重复3次，取均值.细胞培养5 d后，每孔加入mtt溶液（5 g・l-l) 20 ul,温箱内培养4 h后，吸弃孔内上清，每孔内 加入150 ul纯dms0,震荡10 min,使结晶充分溶解，选择490 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度a值.图1兔骨髓基质细胞染色(略)1.2. 1碱性磷酸酶(alp)第4代培养细胞长满后，胰酶消化制 成密度为1 x 107 l-1的细胞悬液，接种于事先放入盖玻片的24孔板 内，按12分组方法加

11、入不同剂量bfgf.培养5 d后取出盖玻片，4°c 生理盐水冲洗，置于冷丙酮中固定15 min,而后用改良钙钻法染色 (fig 2).去除上清，用 10 minol・l-l pbs 冲洗 3 次，吸干, 每孔加 1 ml・l-l triton x100 50 ul 置 4°c冰箱过夜，镜 下观察已无明显细胞结构，经反复吹打后加入alp检测试剂盒内新配 置的底物100 ul/孔，温箱内30 min,每孔加0.2 mol・l-l naoh 50 ul终止反应.在酶联免疫检测仪上选择410 nm波长检测 各孔吸光度

12、a值.图2兔骨髓基质细胞碱性磷酸酶染色，以胞质内有黑色颗粒堆积 者为阳性(略)1.2.2体外成骨能力测定取第4代骨髓基质细胞，传代后按1x107 l-1细胞密度接种于有条形盖玻片的培养瓶内，加入条件培 养液，按12分组方法加入不同剂量bfgf.置于标准环境下培养， 隔日换液1次，连续观察细胞生长情况，记录钙化结节形成过程，培 养4 wk后取出盖玻片，在取出之前加入终浓度为100 mg・l-l 的四环素溶液，继续培养30 min,后取出盖玻片，pbs液冲洗3次, 置于荧光显微镜下观察，而后用40 g・l-1多聚甲醛固定，行 von kossa法钙染色，

13、做图像分析，随机抽取不同视野6次，计算平 均矿化面积百分比.1. 2. 3vegf免疫组化染色取第4代细胞，传代后调整细胞密度至 1x107 l-1,接种于事先放入盖玻片的24孔板内，按1.2分组方法 加入不同剂量bfgf.图3兔骨髓基质细胞vegf免疫组化染色（略）培养5 d后（中间换液1次），取出盖玻片.采用sabc法检测 vegf基因的表达.i抗按1 ： 30加在玻片上，4°c过夜后，加入sabc 37°c反应20 min, pbs洗2次.最后用dab显色，苏木素轻度复染, 常规脱水、透明、封片，显微镜观察并摄片.vegf免疫组化染色， 以胞质和（或）胞膜有明确棕黄色

14、着色者为阳性细胞（fig 3）. vegf 阳性部位主要位于胞质，细胞外基质也可见阳性反应.随机记数高倍 视野，计算阳性细胞率.统计学处理：所测数据用sas统计分析软件处理,数值用x土 s表示， 并经方差分析检验差异显著性.2结果经方差齐性检验，细胞记数、mtt检测、alp活性、矿化面积百分率符合方差齐性，f值分别为65. 50, 22. 47, 1112和8. 33, p<0. 01,显示细胞增殖情况、alp活性、 矿化面积百分率、vegf阳性细胞率各剂量组间差异均显著；在vegf 阳性细胞率检测指标上，各剂量组间方差不齐，使用非参数统计的秩 和检验,h=49.682&

15、gt; x2, p<0.01,认为各剂量组间差异也有显 著性意义.结合各剂量组均值与snkq检验，显示bfgf对刺激骨髓基质细胞 增殖及表达vegf有明显促进作用，并存在明显的剂量依赖关系，其最 佳剂量为1200 kul-1左右,高于此剂量则有下降趋势，表现出双向 作用alp活性及矿化面积百分率检测，各剂量组间差距无明显规律 性(tab 1, 2).表1表2(略)3讨论bfgf是一种毛细血管增殖刺激剂，能促进毛细血管向骨移植物 中长入，加速需要血供的软骨内化骨，bfgf可以升高大鼠骨髓基质 细胞中钙化结节形成率及骨钙素水平3,还可提高鼠成骨样细胞中 主要表达连接蛋白的表达水平4,

16、并且都具有剂量依赖性.vegf 作为促使内皮细胞增殖、趋化的特异性细胞素，在骨形成与代谢中过 程中发挥着重要的作用5.我们选取具有强的成骨潜能和多向分 化能力的骨髓基质细胞6作为靶细胞，并用不同剂量bfgf加以诱 导.从统计数据结果分析，bfgf对刺激骨髓基质细胞表达vegf有 明显促进作用，并存在明显的剂量依赖关系.其最佳剂量为1200 ku・l-l左右，高于此剂量则有下降趋势，表现出双向作用.同 时，bfgf对于骨髓基质细胞还表现出明显促增殖作用，细胞的增殖 周期随着bfgf浓度的增加而缩短，当bfgf的浓度为1200 ku・l-l时，促增殖作用

17、达到最强.在促进骨髓基质细胞成骨 潜能方面，单独应用bfgf无明显作用.骨组织工程中，种子细胞与 支架结合后的增殖过程并不快，另外，植入的骨组织在宿主体内良好 的生长是也骨组织工程研究中的一个课题.bfgf具有明显促进骨髓 基质细胞增殖的作用，还可通过促血管壁细胞增生的重要介质vegf 促进血管内皮细胞有丝分裂并增强其分化，二者协同作用，加强局部 血管增生、渗入和增加局部血流量7,从而可以较好的解决上述问 题，加速骨形成及修复过程.但是，在骨组织工程中单独应用bfgf 也有其不足之处，如果将其与其他一些可以促进骨髓基质细胞成骨表达的细胞因子联合应用，也许会取得更好的效果8.【参考文献】1 na

18、kagawa m, kaneda t, arakawa t, morita s, sato t,yomada t, hanada k, kumegawa m, hakeda y vascular endothelial growth factor (vegf) directly enhances osteoclastic bone rcsorption and survival of mature osteoclasts j febs lett, 2000;473(2):161-164.2 peng h, wright v, usas a, gearhart b, shen hc, cummi

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20、 univ), 2003;24(2):119-122.4 hong x, duan yz, zhang sz, liu x, zhou hx. effects of bfgf on cx43 expression on rat osteoblastoid cells ros17/2 8j . disi junyi daxue xuebao (j fourth mil med univ),2001;22(19):1755-1758.5 carlevaro mf, cermelli s, cancedda r, descalzi cancedda f. vascular endothelial growth factor (vegf) in cartilage neovascularization an