牙周炎常见菌对抗菌药物的筛选及活性测定

1、    牙周炎常见菌对抗菌药物的筛选及活性测定        【摘要】目的通过对18种抗生素的筛选和活性测定，找出不同类型牙周炎治疗的最佳药物。方法选用牙周炎主要致病菌的国际标准菌株及临床分离菌，用琼脂平板稀释法测出药物的最低抑菌浓度(MIC)。结果克林霉素、环丙沙星、二甲基四环素对各类牙周炎主要致病菌的抑菌效果均较好，而二甲基四环素的抗菌谱更为理想。结论牙周炎急性发作时，二甲基四环素可做为首选药；并为多种抗生素的使用及研究提供了实验依据。【关键词】牙周炎抗生素最低抑菌浓度(

2、MIC) 使用牙周炎常见致病菌的国际标准菌株，对常用的抗菌药物进行筛选，得出药物最低抑菌浓度(MIC)，并选出其中三种抑菌效果好的抗生素，用临床牙周炎病人牙周袋内菌斑分离出的致病微生物，进行药物抑菌活性测定，力求在临床上对牙周炎治疗的合理用药有所帮助。材料和方法一、材料1.菌株(国际标准菌株)：药敏指示菌(共2株)脆弱类杆菌：ATCC 29285；多形类杆菌ATCC 29741。国际标准菌株(共19株)卟啉单胞菌：牙龈卟啉单胞菌：47A-1，2561，14-3-2；不解糖卟啉单胞菌：ATCC 25260；牙髓卟啉单胞菌：ATCC 35406。普氏菌：中间型普氏菌：ATCC 25261；卢氏普氏

3、菌：ATCC 15930；躯体普氏菌：ATCC 33547。放线菌：内氏放线菌：ATCC 19039；粘性放线菌：ATCC 19246。伴放线放线杆菌：75#，ATCC 24523。嗜二氧化碳菌：牙龈嗜二氧化碳菌：ATCC 33624；黄褐色嗜二氧化碳菌：FDC-CO，ATCC 27872。血链球菌。嗜沫嗜血杆菌。韦荣氏球菌：ATCC 17743；巨核梭形杆菌：ATCC 10953。分离菌株(临床诊断为牙周炎病人牙周袋内分离、鉴定菌株，共264株)：产黑色素菌群(81株)；放线菌(57株)；梭形杆菌(58株)；类杆菌(19株)；伴放线放线杆菌(12株)；韦荣氏球菌(12株)；嗜沫嗜血杆菌(11

4、株)；其它厌氧菌(14株)。2.抗菌药物(由中国药品生物制品检定所，抗生素研究室提供，共18种)：大环内酯类：红霉素，交沙霉素，麦白霉素，罗红霉素，阿齐霉素，克拉霉素，乙酰螺旋霉素。喹诺酮类：诺氟沙星，氧氟沙星，环丙沙星，洛美沙星，左旋氧氟沙星，曲氟沙星。硝咪唑类：甲硝唑，替硝唑。四环素类：二甲胺四环素，强力霉素。其他：克林霉素。3.培养基：CDC固体(加5%羊血)及CDC液体，选择培养基(产黑色素菌群、放线菌、梭形杆菌、伴放线放线杆菌)。4.细菌生化鉴定管。英国产细菌点种仪。二、方法1.药物筛选试验13：菌悬液制备：把21株国际标准菌株接种在固体CDC培养基上，37，厌氧培养5天，取新鲜细菌

5、菌落置2ml液体CDC培养基中，37，厌氧培养2天后，用液体CDC培养基稀释至106浓度待用。药敏培养基制备：18种药物标准品有效浓度从256mg/L倍比稀释到0.0625mg/L，共13个浓度，以1ml药液加14ml培养基与加好羊血约55的CDC培养基混匀，铺平皿，每个药从稀到浓铺13个平皿，并设二个无药空白对照。细菌点种：用点种仪把稀释好的菌液先点种到空白培养基上(前对照)，再点种到药敏培养基上，13个浓度点种完，最后再点种到空白培养基上(后对照)，放置于37，厌氧环境中培养5天后，观察最低抑菌浓度(MIC)。结果判断：高度敏感：平均血药浓度超过细菌MIC的5倍；中度敏感：平均血药浓度略大

6、于或等于细菌MIC；耐药：平均血药浓度低于细菌MIC4。2.药物活性测定试验：从临床诊断为牙周炎患者的牙周袋内取龈下菌斑，用选择培养基培养致病菌株，根据菌体形态、菌落形态及生化反应，分离出7个菌属(群)5，6，264株致病菌。菌悬液制备：用临床分离的264株菌制备。药敏培养基制备：选用药物筛选试验效果好的三种抗生素(二甲胺四环素，环丙沙星，克林霉素)。细菌点种。观察264株临床分离菌株，对3种抗生素(二甲胺四环素，环丙沙星，克林霉素)的药物活性，即有效抑菌范围(MIC范围)、半数抑菌范围(MIC50)、90%抑菌范围(MIC90)。结果判断：用平均血药浓度与MIC范围、MIC50、MIC90比

7、较。结果对成年人牙周病的主要致病厌氧菌抑菌效果好的抗生素及甲硝唑、替硝唑的最低抑菌浓度(MIC)、与血药浓度均值或范围的比较见表1(牙龈卟啉单胞菌47A-1为耐药菌)。表1成年人牙周炎主要厌氧致病菌MIC及血药浓度均值或范围(mg/L)血药浓度均值/范围牙龈卟啉单胞菌中间型普氏菌25261粘性放线菌19246巨核梭形杆菌1095347A-114-3-22561克林霉素1-3.5320.060.060.060.50.06环丙沙星1.8-2.610.250.25221二甲胺四环素2.5320.250.250.2510.25强力霉素1.1-3.1640.130.510.50.25克拉霉素1-2320

8、.060.250.060.0632罗红霉素1-22560.130.130.060.06256交沙霉素12560.060.060.250.0616甲硝唑6.2640.060.564641替硝唑6.2640.060.06643232药物筛选试验中，二甲胺四环素、环丙沙星、克林霉素的抑菌效果较好，选用这三种抗生素，用临床分离的264株菌株，进行药物的活性测定，得出有效MIC范围，MIC50，MIC90，见表2。 表2二甲胺四环素、环丙沙星、克林霉素的抑菌活性(mg/L)菌种株数二甲胺四环素环丙沙星克林霉素MICMIC50MIC90MICMIC50MIC90MICMIC50MIC90产黑色素菌群810

9、.06640.2520.062560.2540.062560.2516放线菌570.0664180.0632480.062560.516梭形杆菌580.06640.540.061280.540.06256164类杆菌190.06641160.06161160.062560.5128伴放线放线杆菌120.06640.580.0610.2510.062560.12516韦荣氏球菌120.06640.520.0616140.06640.1254嗜沫嗜血杆菌110.06640.520.0680.540.061614其它厌氧菌140.0664140.06320.540.061280.1252讨论牙周炎的

10、类型不同，其致病菌也不同，多数研究认为成年人牙周病致病菌为牙龈卟啉单胞菌、粘性放线菌、巨核梭形杆菌、中间普氏菌等；二甲胺四环素、环丙沙星、克林霉素、强力霉素对它们为高、中度敏感；克拉霉素、罗红霉素、交沙霉素除对巨核梭形杆菌不敏感外，对其它菌抑菌效果很好；甲硝唑、替硝唑只对牙龈卟啉单胞菌敏感，对其它菌不敏感。青少年牙周炎的致病菌为伴放线放线杆菌、黄褐色嗜二氧化碳菌等，对它们敏感的药有环丙沙星、克林霉素、强力霉素、二甲胺四环素，而罗红霉素只对黄褐色嗜二氧化碳菌敏感，甲硝唑、替硝唑对这两种菌不十分敏感。在药物筛选试验中，二甲胺四环素、环丙沙星、克林霉素的抑菌效果好；用临床分离的264菌株进行药物的活

11、性测定，以二甲胺四环素的效果最佳。它为半合成四环素类，抗菌谱较广，抗菌活性强，具有高效、长效且易渗透进入许多组织和体液中，在唾液和泪液中药物浓度比其他四环素类高7，故它适用于控制牙周的急性炎症。(本文编辑王植三)北京市科委基金资助课题(952131400)作者单位：任蕾（100050 北京，首都医科大学附属北京口腔医院）杨圣辉（100050 北京，首都医科大学附属北京口腔医院）刘颖（100050 北京，首都医科大学附属北京口腔医院）参考文献1，王以光，主译.抗生素多学科研究入门.第1版.北京：人民卫生出版社，1998，69：16.2，戴自英，主编.临床抗菌药物学.第1版.北京：人民卫生出版社，1985，9.3，National committee for clinical laboratory standards.Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria-Second Ed,Tentative Standard.Villanova,Pa.NCCLS,Vol.9 No 10.661.4，徐叔云，主编.现代实用临床药理学.第1版.北京：华夏出版社，1996，951：958.5，Holt JG,Krieg NR,Sneath PHA,et al.Bergey?s Manu