半定量RT-PCR的试验原理和方法步骤

1、半定虽RT-PCR勺实验原理和方法步骤以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提 取冻存已裂解的细胞，室温放置 5分钟使其完全溶解。 两相分离 每1ml的TRIZOL式剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。 手动剧烈振荡管体15秒后，15到30 C孵育2到3分钟。4C下12000rpm离心 15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL式剂的60%。 RNA沉淀 将水相上层转移到一十净无 RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混 合以沉淀其中的RNA混匀后15到30C孵育10分钟后，于4C下12

2、000rpm离 心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 RNA活洗 移去上活液，每1mlTRIZOLi式剂裂解的样品中加入至少1ml的75% 乙醇（75%乙醇用DEPCHO配制），活洗RNA沉淀。混匀后，4C下7000rpm离 心5分钟。 RNA十燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使 RNA沉淀在室温空气中十燥5-10分 钟。 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40 用枪反复吹打几次， 使其完全溶解，获得的RNA溶液保存T -80 C待用。2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:

3、100） 后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和 纯度。 浓度测定A260下读值为1表示40 g RNA/ml样品RNA浓度（g/m此算公式为：A260 X 稀释倍数X 40从g/m具体计算如下：RNA溶于 40 l DEPC中，取 5ul, 1:100 稀释至 495 的 TE中，测得 A260 = 0.21 RNA 浓度=0.21 X 100 X 40 小 g/ml = 840 或 0的0 g/ 小 l 取5ul用来测量以后，剩余样品 RNA为35心剩余RNA总量为： 35 l X 0.84 g/ l = 29.4 g 纯度检测RNA溶液的A260/

4、A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60C, 10 ml的10X MOPS泳缓冲液和18 ml 的37%甲醛溶液（12.3 M）。10X MOP食泳缓冲液浓度成分0.4M MOPS, pH 7.00.1M乙酸钠0.01M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入 25 溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1 x MOPS!泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 准备RNA样品取3 gRNA加3倍体积的甲醛上样染液，加 EB于甲醛上样染液中至终浓度为 10 g/mJ加热至70C孵育15分钟使样品变性。 电

5、泳上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5 -6V/cm电压下2h,电泳 至漠酚兰指示剂进胶至少2 3cm。 紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提 RNA的物种类 型），上面一条带的密度大约是下面一条带的 2倍。还有可能观察到一个更小稍 微扩散的带，它由低分子量的RNA（ tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S 核糖体带之间可以看到一片弥散的 EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA 组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出 现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为

6、核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDNA合成反应体系序号反应物剂量1 逆转录 buffer 2 12上游引物0.213下游引物0.2从14 dNTP 0.115逆转录酶MMLV 0.516 DEP冰 517 RNA" 2 从 18总体积10从1轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 混合液在加入逆转录酶 MMLV之前先70C十浴3分钟，取出后立即冰水浴至 管内外温度一致，然后加逆转录酶 0.5 1 37 C水浴60分钟。 取出后立即95C十浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存T -80C 待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（&

7、actin）实时定量PCR &actin阳性棋板的标准梯度制备 阳性棋板的浓度为1011,反应前取3按10 倍稀释（加水27并充分混匀）为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、 104,以备用。 反应体系如下：标准品反应体系序号反应物剂量1 SYBR Green 1染料 10 心2阳性棋板上游引物F 0.5心3阳性棋板下游引物R 0.5心4 dNTP 0.515 Taq 酶 1 16阳性棋板DNA 5从17 ddH2O 32.518总体积50 1轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基因反应体系：序号反应物剂量1 SYBR Green 料 10 心2内参

8、照上游引物F 0.5心3内参照下游引物R 0.5心4 dNTP 0.515 Taq 酶 1 16待测样品cDNA 5 17 ddH2O 32.518总体积50 1轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93C 2分钟，然后93C 1分钟，55 C 2分钟，共40个循环。5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的 DNA棋板 针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA棋板进行PCRK应。 反应体系：序号反应物剂量1 10 x PCR中液 2.5 ul2 MgC2 溶液 1.5 ul3上游引物F 0.5 ul4下游引物R 0.5 ul5 d

9、NTP混合液3 ul6 Taq聚合酶1 ul7 cDNA 1 ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。35个PCRffi环（94C 1分钟；55C 1分钟；72C 1分钟）；72oC延伸5分钟。 PCB物与DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，漠化乙锭染色,检测 PCR产 物是否为单一特异性扩增条带。 将PCRT物进行10倍梯度稀释：将PCRT物进行10倍梯度稀释：设定PCB 物浓度为1X 10°,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。6待测样品的待测基因实时定量 PCR所有cDNA样品分别配置实时定量 PCRS应体

10、系。体系配置如下：序号反应物剂量1 SYBR Green 10 ul2上游引物1ul3下游引物1ul4 dNTP 1ul5 Taq聚合酶2ul6待测样品cDNA 5ul7 ddH2O 30ul 8总体积50 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCF上进行PORT增反应。反应条件 为：93C 2分钟预变性，然后按93C 1分钟，55C 1分钟，72C 1分钟，共40 做个循环，最后72C 7分钟延伸。7实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0,并遵循以下原则：引物与棋板的序歹0紧密互 补；引物与引物之

11、间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在棋板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。8电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView?染色，检测PCR产物是否为单一特异 性扩增条带。RT-PC略以RNA为棋板的cDNA合成同PCR吉合在一起，提供了一种分析基因 表达的快速灵敏的方法。RT-PC闻于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技 术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCRt其他包括Northern印迹、RNase呆护分析、原位杂交及 S1核酸酶分析在内的RNA 分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR勺棋板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA逆转录反应可以使用逆转录 酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物(GS