酵母RNA 的提取、鉴定和定量测定实验十

1、一、一、RNARNA基团鉴定基团鉴定二、电泳分离鉴定二、电泳分离鉴定三、光谱鉴定三、光谱鉴定四、纯度鉴定四、纯度鉴定实验原理实验原理稀碱法稀碱法RNARNA提取方法方法与分类提取方法方法与分类硼酸硼酸干燥，称重，计算提取率（并保存好干燥，称重，计算提取率（并保存好RNARNA）RNARNA含量测定之一：地衣酚法含量测定之一：地衣酚法RNARNA的地衣酚法定量测定原理的地衣酚法定量测定原理RNARNA含量测定之一含量测定之一：地衣酚法测定。：地衣酚法测定。 反应原理：当反应原理：当RNARNA与浓盐酸共热时，即发生降解，与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成形成的核糖继而转变成糠醛糠醛

2、，后者与，后者与3 3，5-5-二二羟基甲苯羟基甲苯（地衣酚地衣酚 orcinolorcinol）反应，在）反应，在FeFe3+3+或或CuCu2+2+催化下，生成催化下，生成鲜绿色鲜绿色复合物。反应产物在复合物。反应产物在670 nm670 nm处有最大吸收。处有最大吸收。RNARNA浓度在浓度在20-20-250g/ml250g/ml范围内，光密度与范围内，光密度与RNARNA浓度成正比。浓度成正比。max=670 nmA A、核糖鉴定、核糖鉴定： RNAH2SO4100 管管 号号 试试 剂剂0 01 12 23 34 45 5标准标准RNARNA溶液溶液（mlml）(100g/ml)(

3、100g/ml)0 00.40.40.80.81.21.21.61.62.02.0蒸馏水（蒸馏水（mlml）2.02.01.61.61.21.20.80.80.40.40 0地衣酚试剂地衣酚试剂（mlml）2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0（2 2）样品的测定）样品的测定准确称取准确称取0.1 g0.1 g提取的酵母提取的酵母RNARNA，放入小烧杯中，加少，放入小烧杯中，加少量蒸馏水调成糊状，溶解，若不溶，则滴入少量量蒸馏水调成糊状，溶解，若不溶，则滴入少量5%-6%5%-6%氨水助溶，调氨水助溶，调pHpH至至7.07.0，小心转移到，小心转移到25

4、ml25 ml容量瓶中，容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，混匀。取用蒸馏水定容到刻度，混匀。取1.0 1.0 mlml样品液样品液稀释稀释4040倍倍后，分别取后，分别取2 2份份2.0 ml2.0 ml的稀释液，加入的稀释液，加入2.0 ml2.0 ml的地衣的地衣酚试剂，混匀，与标准曲线的各管同时置酚试剂，混匀，与标准曲线的各管同时置沸沸水浴中加水浴中加热热4545分钟，冷却，测定分钟，冷却，测定O.D 670670。100/mlgmlg待测液中制品的浓度待测液中测得的浓度nRNARNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸组分，含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸组分，加硫酸煮沸可使其水解，用硝酸银、地衣

5、加硫酸煮沸可使其水解，用硝酸银、地衣酚和定磷试剂可分别鉴定嘌呤碱、核糖和酚和定磷试剂可分别鉴定嘌呤碱、核糖和磷酸组分。磷酸组分。 A、嘌呤鉴定、嘌呤鉴定：嘌呤嘌呤 嘌呤银化物嘌呤银化物（白色或红棕色）（白色或红棕色）AgNO3RNAH2SO4100操作方法操作方法取两支离心管，向第一支管中加入取两支离心管，向第一支管中加入2 ml2 ml样品溶液和样品溶液和2 ml2 ml蒸馏水。第二支管中加入蒸馏水。第二支管中加入2 2 mlml样品溶液和样品溶液和2 ml2 ml沉淀剂。混匀。沉淀剂。混匀。 在冰浴中放置在冰浴中放置3030分钟，然后离心分钟，然后离心1010分钟，分钟，30003000转

6、转/ /分钟。分钟。 从各管中取出从各管中取出0.25 ml0.25 ml上清液，用蒸馏上清液，用蒸馏水定容到水定容到25 ml25 ml。 于于260nm260nm处测定其处测定其光吸收光吸收值（值（OD1OD1、OD2OD2）RNARNA吸收光谱曲线。吸收光谱曲线。剂i 1 1、推入黑体遮光预热、推入黑体遮光预热2、 在在 “T” 位置位置调调 “0”3、在在 “T” 位置调位置调 “100”4、按到、按到 “A” 位置测定位置测定UV-2000醋酸纤维薄膜电泳装置示意图醋酸纤维薄膜电泳装置示意图1. 1. 滤纸桥滤纸桥 2. 2. 电泳槽电泳槽 3. 3. 醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜

7、4. 4. 电泳槽膜支架电泳槽膜支架 5. 5. 电极室中央隔板电极室中央隔板（1）市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在151530s30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳。均匀可用于电泳。（2 2）醋酸纤维素薄膜电泳常选用）醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6pH8.6巴比妥巴比巴比妥巴比妥钠缓冲液，其浓度为妥钠缓冲液，其浓度为0.050.050.09mol/L0.09mol/L。选择何种浓。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则带泳动速度快，区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。（3 3）点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液