常见血液肿瘤FISH检测小册

1、常见血液肿瘤FISH检测小册一.FISH是什么FISH即荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization ),是在细胞遗传学水平上检测染色体及基因 数目和结构异常的一种分子病理检测技术。其基本原理是 利用标记了荧光素的核酸作为探针，按照碱基互补原则， 与待检样本中与之互补的核酸经过变性-退火而形成杂交 双链核酸，然后通过荧光显微镜进行检测和分析。FISH技术具有直观、快速、敏感性高和方便灵活等 特点，目前已经广泛应用于临床的肿瘤遗传学及各种基因 相关疾病的分型与个体化治疗等多个领域。二.血液肿瘤的诊断分型MICM :血液肿瘤诊断的精确分型是临床选择正确治

2、疗方案的前提，目前国际上通用的是结合细胞形态学(Morphology )、免疫学(Immunology )、细胞遗传学(Cytogenetics)和分子生物学(Molecular)的 MICM 分 型。形态学诊断(Morphology)细胞学：外周血、骨髓涂片，淋巴结穿刺组织学：骨髓、淋巴结活检免疫学检查(Immunology)免疫组化(IHC),流式细胞(FCM)细胞遗传学检查(Cytogenetics)核型分析，荧光原位杂交(FISH)分子生物学检查(Molecular)PCR, DNA 测序三.FISH技术的作用及优势FISH作为一项很重要的分子遗传学检测技术， 在血液 肿瘤的诊断中有很

3、大的作用，得到了 NCCN等国内外各大 血液肿瘤诊疗指南的认可和建议。目前与血液肿瘤相关的 FISH探针有接近100种，常 用的就有60种左右，包括急慢性白血病、骨髓增生异常综 合症（MDS ）、多发性骨髓瘤（MM ）、淋巴瘤等多种血液 肿瘤。FISH技术的相对优势：FISH技术更敏感，可检测出核型分析检测不出的细微缺失或易位，如 MDS中的5q缺失综合征；FISH技术不需要中期分裂相细胞，而核型分析需要 培养时间较长且需要较高的操作要求；FISH技术是在细胞形态的基础上进行结果判读，可有效地降低假阴性或假阳性的风险，而 PCR技术经 过倍增扩增，不能在形态的基础上判读， 对实验要求 高，易产

4、生假阴性或假阳性。四. 常用的血液FISH检测探针1急性粒细胞白血病（AML）:样本建议骨髓 AML1/ET。融合基因（M2b分型） PML/RARA融合基因（M3分型） CBFB基因断裂（M4分型） KMT2A （MLL）基因断裂（预后差，治疗失败风险高） 其他：口 8号染色体、口 CBFB/MYH11基因融合、口 RARA基因断裂、 5q缺失、口 7q缺失、 EVI基因断裂2慢性粒细胞白血病（CML）:样本优先骨髓 BCR/ABL （DF）融合基因检测（指导格列卫用药） 嗜酸性粒细胞增多症（格列卫作用靶标）: PDGFRA基因断 裂、口 PDGFR曜因断裂、 FGFR1S因断裂 其他：口

5、BCR/ABL（ ES、BCR/ABL SE、 i （ 17q）、口 ASS 基因缺失3 急性淋巴细胞白血病（ ALD：样本建议骨髓 ETV6（ TEL /AML1融合基因（预后较好，但易复发） TCF3（ E2A）基因断裂（标准化疗后易早期复发） BCR/AB通合基因（易迅速复发，对挽救性化疗反应不佳） 儿童急性淋巴细胞白血病染色体及基因异常（4、10、17、TEL/AML1、KMT2A基因断裂、BCR/ABL(DFK预后评估及治 疗方案的选择) 其他：口 TCF3( E2f /PBX1、口 4、10、17; MYC 基因断 裂、 IGH基因断裂、口 KMT2A基因断裂、口 CDKN2A (

6、P16) 基因缺失4慢性淋巴细胞白血病(CLI)：样本优先外周血或骨髓 慢性淋巴细胞白血病染色体及基因异常(P53、RB1 (13q14)、ATM(11q22)、D13S25 (13q14)、12,预后评估及治疗方案 的选择) 其他：口 DLEU1 (13q14)、 P53、ATM (11q22)、口 MYC 基因扩增、口 6q、口 TERC 口 GLI、口 12、口 BCL2/IGH、 CCND3/IGH5骨髓增生异常综合症(MDS):样本建议骨髓 骨髓增生异常综合症染色体及基因异常(5q、7q、20q、8、X/Y,预后评估及治疗方案的选择) 其他：口 5q、口 7q、 20q、 EGR&l

7、t; EVI1 基因断裂、口X/Y6多发性骨髓瘤(MM ):样本建议骨髓 多发性骨髓瘤染色体及基因异常(P53、1q21、RB1 (13q14)、 D13S319 (13q14 )、IGH,预后评估及治疗方案的选择) 其他：口 CCND1(BCL1) /IGH、口 MAF/IGH、口 FGFR3/IGH MAFB/IGHk CCND3/IGH. 11q23 及 DLEU1 P53、 15q22 及 6q21、 1q21 及 1p36、口 IGH 基因断裂7淋巴瘤：样本建议骨髓或淋巴结穿刺 MYC/IGH融合基因（辅助诊断伯基特淋巴瘤、高分级 B细胞 淋巴瘤的治疗） BCL2/IGH融合基因（辅

8、助诊断滤泡性淋巴瘤） ALK基因断裂（辅助诊断间变性大细胞淋巴瘤，指导克晚替尼 用药） CCND1 （ BCL1 /IGH融合基因（辅助诊断套细胞淋巴瘤，鉴 别诊断MCL和CLD IGH基因断裂（发生于多种类型的淋巴瘤中，与超过 50种基 因融合） MALT1基因断裂（辅助诊断粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，指导HPBCL6DLBCL8骨髓移植后嵌合状态监测（X、Y） X和丫染色体检测五. 常见血液肿瘤FISH探针介绍血液肿瘤中常见 FISH探针有四种类型，应用于基 因融合、断裂、扩增和缺失检测。检测类型探针举例所含靶标正常信号典型异常信号基因融合BCR/ABL （DF）融合基因检测探针GSP BCR

9、GSP ABL©基因断裂IGH基因断裂检测探针GSP IGH©基因扩增MYC基因扩增检测探针GSP MYCCSP 8©©基因缺失P53基因缺失检测探针GSP P53CSP 17©*红色标记表示该基因探针标记红色荧光素（R）,荧光显微镜相应滤块下观察为红色信号点（某些参数滤块下显示为橙色信号）；*绿色标记表示该基因探针标记了绿色荧光素（G）,荧光显微镜相应滤块下观察为绿点信号点；*黄色标记表示该基因探针包含一组分别标记了红、绿两种荧光素的探针组合，荧光显微镜单通道滤块下可观察到相 应颜色信号点（绿色或红色信号点），双通道滤块下可观察 到红绿相邻或

10、重叠信号（融合，F）o1.急性粒细胞白血病（AML ）常用FISH检测靶标：AML1/ETO基因融合、PML/RARA基因融合、CBFB基因断裂、MLL基因断裂AML1 /ETO融合基因检测 一M2b分型的标志1）辅助诊断：AML1/ETO融合基因在 M2患者中的发生率 20%-40%，在 M2b亚型中发生率高达 90%，是 M2b分型 的标志，在M1和M4中少见。2）判断预后：AML1/ETO融合基因阳性是预后好的标志，患者对治疗反应佳，完全缓解率可达90%, 5年无病生存可达 50%-70%。PML /RARA融合基因检测 一M3分型的标志1）辅助诊断：PML/RARA融合基因可见于 95

11、%以上的APL 中，成为 M3的一个特异标志，预后好，约占全部 AML 的9%。2）指导用药：全反式维甲酸（ATRA）和三氧化二碑能靶 向降解PML/RARA 融合蛋白，恢复野生型 PML和RARA 基因功能，解除其对基因转录的抑制，诱导细胞发生分化和凋亡，使APL得到有效治疗。ATRA与化疗联合使用可 使APL的完全缓解率达 90%-95%，并可使70%以上的患 者得到长期生存。CBFB基因断裂一M4E0特征性的遗传学改变1) 辅助诊断：CBFB基因断裂重组是 AML的特征性染色 体异常，占总AML患者的5%-10%和23%的M4患者，通 常见于AML-M4E0 亚型，在M2 , M5及M4

12、 (无嗜酸性粒 细胞增多)中较少。现在认为CBFB基因断裂重组是 M4E0 特征性的遗传学改变。2) 判断预后：大多数 CBFB基因断裂重组的 AML患者对 化疗敏感、预后较好。MLL基因断裂1) 辅助诊断：在成人急性髓细胞白血病 (AML)中，则主要 见于M4/M5亚型。2) 判断预后：除t(9 ; 11), t(10; 11)以外，大部分 MLL 重排白血病缓解率低，并且第一次缓解后极易复发，生存 期短，预后很差。在AML中单纯MLL断裂提示预后中等。2.慢性粒细胞白血病(CML )常用FISH检测靶标：BCR/ABL基因融合BCR/ABL融合基因检测 一CML诊断的 金标准”1) 辅助诊

13、断：t(9; 22)(q34; q11)易位形成的BCR/ABL融 合基因是CML的标志物，95%CML患者可检测出典型的 t(9 ; 22)(q34 ; q11)易位，约5%的CML患者通过核型分析 难以检测到Ph染色体，但可检测出融合基因存在， 仍被归 为Ph+ CML分类。2) 指导用药：对初诊患者进行 BCR/ABL检测，可以进行 酪氨酸激酶抑制剂受益人群筛查。格列卫可用于治疗费城染色体阳性的慢性髓性白血病 (Ph+ CML)的慢性期、加速 期或急变期。3) 疗效监测：Ph染色体存在于CML的整个病程中，治疗 缓解后，仍持续存在，只有消除Ph阳性克隆，才能达到最 终治愈。FISH可用于

14、治疗期间患者体内 BCR/ABL融合基 因细胞量动态变化的检测，用于后续的治疗方案选择及药 物使用效果评估。3.嗜酸粒细胞增多症(HE)常用FISH检测靶标：PDGFRA基因断裂、PDGFRB 基因断裂和FGFR1基因断裂2008 年 WHO 将具有 PDGFRA、PDGFRB 或 FGFR1 基因断裂异常，伴嗜酸性粒细胞增多的髓系和淋巴系肿瘤 独立成一个新类"Myeloid/lymphoid neoplasms with eosinophilia associated with rearrangements of PDGFRA, PDGFRB, or FGFR1 ”。这类患者具有

15、PDGFRA基因重排、 PDGFRB基因重排或FGFR1基因重排，即使不伴有 BCR/ABL融合基因，依然对酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(imatinib)治疗敏感，治疗后完全缓解率高。4.急性淋巴细胞白血病(ALL)常用FISH检测靶标：ETV6 (TEL ) /AML1基因融合， TCF3( E2A)基因断裂，BCR/ABL 基因融合，KMT2A ( MLL ) 基因断裂及4、10、17号染色体数目异常ALL中遗传学改变发生的频率可达 80%-90%,遗传学 变异较大，但大部分是特异性改变，与特定的形态学和免 疫学表型有关。ALL中遗传学改变主要是两种形式，一是 染色体结构异常，二是染色体数目

16、的异常。ETV6 (TEL ) /AML1 基因融合ETV6 (TEL) /AML1融合基因在儿童 ALL中的发生率高 达20%-25%，是目前儿童 ALL最常见的染色体重排。大 多数研究发现 ETV6 (TEL) /AML1阳性的儿童 ALL治疗 效果很好，5年EFS和总生存率达到89%和97% ,是预后 良好的指标之一。TCF3 (E2A)基因断裂约3%-5%的儿童ALL携带E2A基因断裂。早期研究认为TCF3 (E2A) /PBX1阳性的ALL患儿易发生早期复发， 预后不佳，故曾将其作为高危因素之一。核型分析容易导 致20%-25%漏诊，而FISH可克服这一缺点。BCR/ABL基因融合t

17、(9 ; 22)易位形成的 BCR/ABL融合基因，约25%成人ALL 及2-10%儿童ALL出现t (9; 22)易位，但已被认为是最 重要的预后不良的因素之一。一旦检测出BCR/ABL融合基因，患儿即被划分为高危，接受更为强烈的化疗或造血 干细胞移植。但大多数患儿仍会治疗失败，5年EFS只有28.6%。MLL基因断裂MLL基因改变在急性白血病中的发生率约为5%-10%,但在婴儿ALL中则高达79% o t(4; 11)(q21 ; q23)易位形成 的MLL/AF4融合基因最为常见(占41%),是预后不良的重 要标志，5年EFS只有26.7%。4、10、17号染色体异常儿童ALL约25%有

18、染色体数目的增加，以4、10、17号染色体受累较为多见。4、10和17染色体三体是独立的预后 良好的指标，这类患者 7年EFS大于90%o5.慢性淋巴细胞白血病（CLL）常用 FISH 检测靶标：13q-, +12 , 17p-, 11q-慢性淋巴细胞白血病是一种进展缓慢、惰性的肿瘤， 约占所有白血病的30%，多起源于B细胞的恶性转化，淋 巴细胞分化受阻于未成熟阶段，易伴发自身免疫病和低丙 球蛋白血症。约 90%的B细胞CLL伴有特异性染色体及 基因异常。由于CLL白血病细胞增殖低下，体外培养增殖 慢，进入分裂中期的细胞少，传统的核型分析有困难。常 规染色体显带技术仅22%CLL可检测到克隆性

19、染色体异常， 由于加用B细胞分裂刺激剂，近50%CLL检测到克隆性染 色体异常。近年来，随着间期FISH技术的应用，CLL染色体异常的检出率大大提高，可达到75%-80% o最常见的为 13q-，其次为 +12、11q-、17p-、14q32 重排、6q-,对这 些遗传学异常的检测可以预测疾病的预后和治疗反应情况。13q-（含 D13S25 和 RB1）13q缺失是CLL最常见的染色体异常， 40%-60%的CLL 出现该异常。单纯 del（13q14）常于BinetA期时出现，预后 较好，或与正常核型患者相似；中位生存期 133个月，无 治疗生存期最长达92个月。若伴有+12、11q-等其它

20、染色 体异常，则预后通常较差。+12 (即 CSP12)+12是最早发现的B-CLL常见染色体异常，其发生率约为 15%-35%，通常伴有其它核型异常。+12患者约50%以上伴有不典型的淋巴细胞形态，SmIg和FMC7强表达，Binet 分期提前，疾病进展，对喋吟类似物的反应较差生存期短， 预后差，因而需要积极的治疗。但仅有+12改变，无复杂核型异常，细胞形态正常者，预后与核型正常者基本相似。17p-(含 P53/CSP17)7%-11%的CLL患者伴有17p (P53)缺失，细胞形态多不 典型，多处于疾病晚期(BinetB、C期)，对多种治疗(包括 核音类似物)反应差，生存期短。具有17p-

21、核型异常的CLL 患者多数预后不良，早期即出现疾病进展，且大多数化疗 方案治疗效果较差，因为多数化疗方案中的细胞毒药物都含有喋吟类似物，其发挥作用主要依赖完好的P53介导的促凋亡机制。因此P53基因是否缺失为临床治疗方案的选 择提供指导，对于有 P53基因缺失的患者，应选用不涉及 P53信号传导系统的药物。11q (ATM )缺失11q-是CLL另外一个预后较差的核型异常，常规核型分析 检出率5%，而应用FISH可以提高到20%。 ATM缺失的 发生率为12%-20%, 一些患者即便在初诊时没有ATM缺 失，但随着疾病进展，可出现 ATM的缺失，提示ATM的 缺失与CLL进展密切相关。6.骨髓

22、髓增生异常综合征（MDS）常用 FISH 检测靶标：5q-, 7q-, 20q-, +8, -Y克隆性细胞遗传学异常可见于40%-70%的原发性MDS和95%左右的治疗相关性 MDS（t-MDS）。晚期阶段的 MDS其染色体畸变率较早期阶段 MDS更高,其类型也更为 复杂。MDS染色体异常检出的高低也和染色体检测的方法 有关：采用CC技术只在31%-49%的原发性MDS患者中 检出染色体异常，而采用FISH结果在79%的MDS中检出 了染色体异常。MDS细胞遗传学异常的类型呈现很大的异质性：包括各种染色体数目和结构异常， 几乎涉及每对染色体。其中， 除5q-见于5q-综合征外，绝大多数缺乏特异

23、性。但MDS的染色体畸变主要以染色体缺失和数目异常（增加或丢失）为主，提示其发病的分子机制主要为肿瘤抑制基因丢失或 失活或者与单倍基因剂量不足有关。MDS染色体异常中累 及5、7、8、20号染色体的异常最为多见，其发生率分别 为20.8%、19.2%、16.9%和6.4%。这些染色体异常既可以 单独出现，也可以联合出现。不同类型的MDS中，染色体异常的发生情况也是不同的。染色体核型对MDS有独立的预后价值。总的倾向是：正常核型比异常核型预后好， 单一异常比复杂异常预后好（-7例外），核型稳定比核型演 变预后好。1997年国际预后积分系统（IPSS）将MDS的染 色体异常分为3种不同的预后亚型：

24、（1）高危：7号染色体 异常和复杂的染色体异常；（2）低危：单纯5q-,单纯20q-, -Y，和正常核型；（3）中危：其他异常，如+8等。5q-（含 TERT /5q33 和 TERT/5q31）5q缺失是AML和MDS中最为常见的重排；5q内部出现 缺失（5q31-q33）出现于10-15%的MDS患者中，而5号 染色体异常约占与治疗相关的MDS的40%以上。-5/5q-的患者预后较好，可用于指导临床进行预后判断和治疗方案 的选择，如可采用促进造血、诱导分化和生物反应调节剂 等方式进行治疗。-5/5q-的MDS患者在接受来那度胺治疗 后可达到完全临床缓解和细胞遗传学缓解，但经常会出现 复发。

25、-7/7q-（含 D7S486/CSP7 和 D7S522/CSP7）7号染色体缺失或7q缺失与MDS的复发性异常相关， 约发生于 5-10%AML （M4 及 M6）、约 15% 成人 MDS、40% 儿童MDS及50%与治疗相关的 AML/MDS 。 -7/7q-的患者 预后较差，可用于指导临床进行预后判断和治疗方案的选 择，如可采用AML联合化疗和造血干细胞移植进行治疗。20q-（即 D20S108）20q缺失见于骨髓增殖性疾病( MPD ) /MDS (4%) /AM(1%)等疾病中。-20/20q-的患者预后较好，可用于指导 临床进行预后判断和治疗方案的选择，如可采用促进造血、 诱导

26、分化和生物反应调节剂等方式进行治疗。+8 (即 CSP8)+8是原发性MDS最常见的核型异常，国内报道+8的检出 概率(21.1%)高于国外(10%),可以出现于FAB分型的 每一种MDS亚型，在IPSS积分系统中属于中等预后指标。7.多发性骨髓瘤（MM ）常用FISH检测靶标：13q-, 17p-, 1q21扩增，IGH基 因断裂多发性骨髓瘤是一种最常见的恶性浆细胞病，占造血系统恶性肿瘤的10%,其特征是单克隆浆细胞恶性增生并 分泌大量单克隆免疫球蛋白，引起骨痛、病理性骨折、造 血异常、单克隆球蛋白血症及肾功能受损等一系列临床变 化。目前通用的 MM诊断标准主要是标准 WHO （2001）

27、和国际MM工作组（2003）。此种疾病容易误诊，误诊率 高达60%。临床研究发现，MM的发生发展中伴随着多种特异的 细胞遗传学层次上的相关基因数目或结构的改变。细胞遗 传学改变在MM发病机制中发挥重要作用，MM常涉及多 种染色体异常，主要为数目异常，染色体核型异常分为超 二倍体和非超二倍体两大类，其中超二倍体常见染色体改 变是 +3、+5、+7、+9、+11、+15、+19、+21。非超二倍体 主要累及-8、-13、-14、-17、-22等。在 MM 染色体异常 中结构改变较少见，主要有1号染色体（1p缺失或1q扩增）、13q-、14q（多为与14q32有关的几种重排）等。染色体分析需要有较好

28、的中期分裂相，由于骨髓瘤细胞为终末分化细胞，增长率较低，很难获得足够分裂相进 行分析，常规细胞遗传学技术检出率低15%-20% , FISH技术可提高至 38%-54%。13q-(含 D13S319 和 RB1)13号染色体部分或完全缺失是 MM常见的染色体异常，在 MM发病机制中较早发现，是该病预后及生存期预测重要 指标之一。采用FISH技术检测检出率可达 30%-50%。RB1 缺失，中位生存期为42.3个月，预后中等；D13S319缺失， 中位生存期为42.3个月，预后中等。P53P53基因异常在初诊的 MM 检出率约 5%-10%。 P53缺失 中位生存期为24.7个月，预后差。P53

29、基因参与细胞的凋 亡过程，它的缺失将导致化疗药物的不敏感性，临床也证 实具有del (17p)异常患者无论是接受传统化疗还是大剂 量化疗，甚至是 ASCT,疗效和生存情况均比基因正常者 差。1q211q21 (CKS1B )是MM中最为常见的遗传学异常，CKS1B基因扩增导致细胞周期循环的上调，从而引起很多增殖性 疾病。1q21扩增往往与MM的浸润表型相关，预后差，疾 病进展快。IGH基因断裂大约40-60%的MM患者发生IGH基因断裂及易位，IGH基因 易位的伙伴染色体，主要包括11q13(BCL1/CCND1)、4p16.3(FGFR3 )、16q23(MAF)、20q11(MAFB)和6

30、p21(CCND3) 等。较常见的易位：t(11 ; 14)(q13; q32)、t(4; 14)(p16; q32)和 t(14 ; 16)(q32; q23)分别大约 20%、15%和 5%患者存 在。t(11; 14)(q13; q32)预后较好，t(4; 14)(p16; q32)的 患者与其他遗传亚型的患者相比具有显著较差的预后。8.淋巴瘤常用FISH检测靶标：CCND1/IGH基因融合、BCL2/IGH基因融合、MYC基因断裂、BCL6基因断裂、MALT1基因断裂CCND1 /IGH基因融合t(11; 14)易位后形成CCND1/IGH融合基因，IGH基因附 近的增强子使CyclinD1过表达应用范围套细胞淋巴瘤的 诊断性指标，95%左右的MCL患者具有t (11; 14) (q13;q32)染色体易位，可用于MCL与其他淋巴瘤(CLL/SLL ) 鉴别诊断。BCL2/IGH基因融合t(14; 18)易位后形成的