1分子生物学常用技术(精)

1、分子生物学常用技术核酸的分子杂交Nucleic acid hybridization分子杂交的原理：DNA具有麦性的特点变性的DNA还能复性分子杂交的概念 分子杂交的原理：用已知的DNA序列制 成探针，来检测末知的样本DNAoDNA分子unnuruiniTIMH HIIIIIIiiIIIII当条件复原时= 复性样本DNAI变性I当条件改变时二变性IfflllUF1变性单链DNA被亠A UM同位素标记_II后制成探针厂/1 1DNA探针II IIIII III I分子杂交的形成:液相杂交相杂交它们之间的区别和优劣固相杂交的一般过程1首先设计、合成探针。2收集标本, 并提取核酸。3将提好的核酸样本

2、点到固相支持物上o4封闭。5通过变性和复性完成杂交。6漂洗7放射自显影核酸分子杂交技术的演变 斑点杂交southern blotnorthern blot原位杂交芯片技术COLONIES斑点杂交disc offabeorbent paperEXPOSE PAFER TOPHOTOGRAPHIC FKMposition of deredoc4onio d redcd。autoradiographYcdarile5 containingpiomdB of ntereutDWbosdtopaperpetri dieh colonicsofboctcrta cont dr Ingfocomtxnan(

3、 (Josnwdsladunativ * IdbvledprobeIMCUBATE NTH PROSEANDWSHLYSE BACTERIADENATURE DlPEL PAPCR FROW DISH TOPRODUCE REPLICA OFsouthern blotsouthern blotfew70I nh rlormM.MITQUIM4*0炖fQMM* an I be Hr* UM.?. Th pH l c ov*rv1 th th at nltrocxitailow endl*marh th* teaftr 4*Mturv tfw MA InAo fQI* TlwtMiVerMrtnI

4、K u( (ithe a*d etro4Mowlto4 tfiuk of pifMr towrhp4acr1 3 $ zRMr*ronte the KMXiukM4. BloUM 0cM nd menX Hoor,lc fUmhMd awr tte Kto*u| ciwiq miqimil HlCh2(5%ernRed = atleast 1SNP perIHWoofgenomewithinCHCMCM啾求的衫咸及安晨 PCR的实现1985年美国PE-Cetus公司 人类遗传研究室的Mullis等发明了具有 划时代意义的聚合酶链反应。其原理类 似于DNA的体内复制，只是在试管中给DN A的体外

5、合成提供一种合适的条件一摸板 DNADNA , ,寡核昔酸引物,DNADNA 聚合 &合适的缓冲体系,DNADNA 变性、施 及延伸的温度与时间.合成 DNADNA 的原料。PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段， 其缺点是： Klenow酶不耐高温，90C会变性失活，每次 循环都要重新加。引物链延伸反应在37C下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配, 其PCR产物特异性较差， 合成的DNA片段不 均一。 此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较 传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热

6、变性时， 会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个 扩增反应周期， 给PCR技术操作程序添了不 少困难。 这使得PCR技术在一段时间内没能 引起生物医学界的足够重视 1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜 热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐 热DNA聚合酶。此酶具有以下特点耐高温, 在70 C下反应2h后其残留活性大于原来的90%,在93 C下反应2h后其残留活性是原来的60%,在95 C下反应2h后其残留活性是原来的40% o在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反 应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)o由于 提高了扩增

7、的特异性和效率，因而其灵敏性也 大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段 区别， 将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)o此酶的发现为PCR技术 的广泛应用打下了基础。to2DPCR技术的实验原理模拟细胞内DNA合成的过程利用了DNA变性、复性和能进行杂交的特 点，在引物存在的条件下DNA聚合酶开始对DN A进行体外合成。通过全自动的热循环仪来完成PCR : Polymerase Chain Reaction30 40 cycles of 3 steps :Step 1 : denaturation1 niinul 94 CnnmnimiiiH mii

8、mi肛门川11?11111口1| ii山川nnirniiiHirni$ErnnEHiIIIHnr【川】iiiiH【rnnTrnrE山川“叩】i【川niinni丁ni77713.丁丄山血呗 3 山刨閱応血1山灿31丿3叭5Step 2 : annealing45 seconds 54 C forwardand reverse primers !?皿1耐|iiinunr川imi nnTTrnirn山川川y、l I、I 一3川HU UULllllllLlLLLiluills 111 S 亠一i _ i , i、 、广 /$/、/i_i、i/ (|Step 3 : extension2 minutes

9、 72 C onlydNTP*s33CI第1轮结束第2轮开始i】mhl】l(ELLLUlP90 C第2轮结束模板DNA.第1.输拡熾十 第2轮扩增第3轮扩增J2C第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR反应的基本条件模板的制备模板是进行 DNADNA 体外扩增的依据，它的来源于不 同的材料。PCRPCR 对模板的质量要求很高，但对它量的 要求不高。制备模板的材料：新鲜材料：人或动物的血液及组织中提取； 从少量材料：痰、尿液、腹腔液等；法医学的材料：血斑、精斑等； 考古材料从以往保存的材料，如石蜡切片的蜡块中。 提取的原理和方法：（略）引物的设计：引物的设计首先要依据你已知的序列来设 计。即你要扩增

10、的目的DNA片段。这些资料 可以从文献上查找或从互联网上来检索。实际做的过程中，引物也可借助于别人已 经发表的引物来。但从经验上说，别人公开 发表的引物常常含有一定的错误。所以要进 行核查。投廿引物应遵循以下原则:1引物长度：15-30bp,15-30bp,常用为 20bp20bp 左右。2引物扩增跨度：以 200-500bp200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb10kb 的片段。引物碱基：G+CG+C 含量以 40-60%40-60%为宜，G+CG+C 太少扩增效果不佳，G+CG+C 过多易出现非特异条带。 ATGCATGC 最好随机分布，避免 5 5 个以上的嚓吟或喘喘核

11、昔酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。5引物端的碱基，特别是最末及倒数第 二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败。6引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这 对酶切分析或分子克隆很有好处。7引物的特异性：引物应与核酸序列数据 库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0 11umol或10100pmoh瓣勰缙噩魅鍬扩增且以最低引物量产生所需要的结果为好，弓IPCR所用试剂：DNA聚合酶buffer:包括两种，一种是含Mg, 种是不含Mg+ odNTPs纯净水咱己要准备的是模板DNA的制备和引 物的设计与合成。PCR的操作过程设定一个加样配方：标准的 PCRPCR 反应体系:10X10X 扩增缓冲液 4 4种 dNTPdNTP 混合物 引物模板 DNADNATaqTaq DNADNA 聚合酶Mg2+Mg2+加双或三蒸水至5ul5ul 各 200umol/L200umol/L各 1010100pmol100pmol0.12ug0.12ug 2.5u2.5u1.5mmol1.5mmol/L/L50uT50uT加样：单样本加样多样本加样加样的顺序PCR反应条件的设定:预就性温度:变性温度: 退火温度: 延伸温度: