湖南农业大学生物化学-02-核酸的结构与功能-03_PDF转换成word转换器

1、 第三章核酸的结构与功能 生物化学（第三版）辅导与习题集（王镜岩生物化学配套辅导）戴余军 著湖北辞书出版社2010 - 06当当价：¥20.80 第三章核酸的结构与功能第一节核酸通论第二节核酸基本构件单位核苷酸第三节 DNA的分子结构第四节 RNA的分子结构第五节核酸的某些理化性质第六节核酸研究常用技术 第五节核酸的某些理化性质一、核酸的水解二、核酸的两性解离性质三、核酸的紫外吸收（max=260nm）四、核酸的变性、复性、增（减）色效应五、核酸的熔解温度（Tm） 一、核酸的水解核酸可被酸、碱或酶水解成为各种组分，其水解程度因水解条件而异，水解产物可用层析、电泳等方法分离。碱水解&#

2、216;RNA能被稀碱水解，在水解过程中，随着磷酸二酯键的断裂，先生成2,3-环核苷酸中间物，最后生成2-核苷酸和3-核苷酸的混合物。ØDNA由于不存在2-OH，对稀碱有一定抗性酸水解在酸性条件下，磷酸酯键比糖苷键更稳定，其中稳定性最差的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键。所以，若对核酸进行酸水解，首先生成的是无嘌呤酸(apurinic acid）。 核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。Ø依据底物不同分类DNA酶(deoxyribonuclease, DNase)：专一降解DNA。RNA酶 (ribonuclease, RNase)：专一降解RNAØ依据切割部位不同。核酸内

3、切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。核酸外切酶：5´3´或3´5´核酸外切酶。 RNase实验室常用的RNase有两种，其一是牛胰核糖核酸酶(pancreatic ribonuclease)，又称RNase I或RNaseA，是一种专一性内切酶，水解产物为3'-嘧啶核苷酸，和以3'-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。其二是核糖核酸酶T1(ribonuclease T1)，水解产物为3'-鸟嘌呤核苷酸，和以3'-鸟嘌呤核苷酸结尾的寡核苷酸。 DNase实验室常用的DNase有牛胰脱氧核糖核酸酶(DNase I, p

4、ancreatic deoxyribonuclease)，可以将单链或双链DNA水解为平均长度为4个核苷酸的，以5'-磷酸为末端的寡聚核苷酸。牛脾脱氧核糖核酸酶(DNase II, spleendeoxyribonuclease)，可以将单链或双链DNA水解为平均长度为6个核苷酸的，以3'-磷酸为末端的寡聚核苷酸。 核酸的一般理化性质1.核酸为两性电解质，通常表现为酸性。2.DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，不溶于有机溶剂。3.DNA溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多。4.RNA能在室温条件下被稀碱水解而DNA对碱稳定。5.沉降行为:不同构象的核酸分子的沉降的速率有很

5、大差异，这是超速离心法提取和纯化核酸的理论基础。 二、核酸的酸碱性质磷酸基的解离胞嘧啶的解离 腺嘌呤核苷酸pK2¢ = 3.7核苷含氮环 pK3 = 6.2第二磷酸基pK1¢ = 0.9第一磷酸基酸的解离曲线鸟嘌呤核苷酸pK2¢ = 3.7含氮环离子pK1¢ = 0.7第一磷酸基pK3¢ = 6.1第二磷酸基烯醇式羟基化程度pK2¢ = 4.3含氮环胞嘧啶核苷酸pK3 = 6.3第二磷酸基pK1¢ = 0.8第一磷酸基尿嘧啶核苷酸pK1¢ = 1.0pK3¢ = 6.4第一磷酸基 第二磷酸基烯醇式羟基pH

6、 三、核酸分子具有强烈的紫外吸收核酸在波长 260nm处有强烈的吸收，是由碱基的共轭双键所决定的。这一特性常用作核酸的定性和定量分析。 碱基的紫外吸收光谱 紫外吸收的应用ØDNA或RNA的定量A260= 1.0相当于50g/mL双链DNA(dsDNA)40g/mL单链DNA (ssDNA or RNA)20g/mL寡核苷酸Ø确定样品中核酸的纯度分别测定蛋白和核酸在260和280的OD值：纯的 DNA两者比值: A260/A280= 1.8纯的RNA两者比值: A260/A280= 2.0 四、核酸的变性、复性变性：在物理、化学因素影响下， DNA碱基对间的氢键断裂，双螺旋解

7、开，这是一个是跃变过程，伴有A260增加（增色效应）,DNA的功能丧失。复性：在一定条件下，变性DNA 单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构，伴有A 260减小（减色效应）,DNA的功能恢复。变性（加热）复性（缓慢冷却） DNA解链时的紫外吸收变化30.40.3123天然DNA21变性DNA光吸收核苷酸总吸收值0.20.1220 240 260 280波长（nm）Ø增色效应 (hyperchromic effect)： DNA变性时其溶液OD260增高的现象。这是由于在双螺旋结构中，碱基有规律的紧密堆积降低了其对紫外光的吸收。 五、DNA的熔解曲线（melting curve）连续加热

8、DNA的过程中以温度相对于 A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。解链温度(melting temperature，Tm)解链过程中，紫外吸光度的变化达到最大吸收（完全变性）的一半时所对应的温度。即此时的 50%的DNA双链被打开DNA的Tm值一般为70-85 影响Tm的因素(1) DNA的均一性越高，Tm的温度范围越小。(2) G-C含量越高， Tm的值越大，若GC的含量上升1%，则Tm上升0.41。马默多蒂（Marmur-Doty）关系式：Tm = 69.3 + 0.41(G + C)%，或GC% =（Tm - 69.3）× 2.44(3) 介质的离子强度较高时， Tm的值较大

9、。（中和负电荷，降低排斥力，稳定DNA结构）(4) 变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等可破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。 第三章核酸的结构与功能第一节核酸通论第二节核酸基本构件单位核苷酸第三节 DNA的分子结构第四节 RNA的分子结构第五节核酸的某些理化性质第六节核酸研究常用技术 第六节核酸研究常用技术一、分子杂交二、PCR三、DNA序列测定 一、核酸分子杂交(hybridization)Ø不同种类的 DNA单链分子或 RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件可以在不同的分子间形成杂交双链(heteroduplex)。Ø这种杂交

10、双链可以在不同的 DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。 分子杂交的应用Ø 研究DNA分子中某一种基因的位置。Ø 鉴定两种核酸分子间的序列相似性。Ø 检测某些专一序列在待检样品中存在与否。 分子杂交探针：用放射性同位素或荧光标记，或特定的基团(如生物素，地高辛)标记的DNA或RNA片段。原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。点杂交：将核酸直接点在膜上，再与核酸杂交。Southern印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。Nor

11、thern印迹法：将电泳分离后的RNA吸印到硝酸纤维素膜上再进行分子杂交。 Northern/Southern Blot基本流程图制备总RNA/DNA样品琼脂糖凝胶电泳印迹转移至薄膜与同位素标记的特异性探针杂交放射性自显影 法可用于检测特异的序列片 基因芯片发展历史Southern & Northern BlotDot BlotMacroarrayMicroarray 基因芯片（Gene Chip）基因芯片,又称DNA微阵列(DNA microarray），将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地高密度地排列固定于支持物上，制成基因微阵列,样品（DNA/RNA）通过PCR扩

12、增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后按碱基配对原理进行杂交，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。可对基因序列及功能进行大规模、高通量地研究。 DNA Microarray analysis of gene expressionTreatment / controlNormal / tumor tissueBrain / liver Image of a DNA Microarray 二、聚合酶链式反应（PCR）定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chainreaction)，是通过模拟体内

13、 DNA复制的方式，在体外选择性地将 DNA某个特殊区域扩增出来的技术。原理：在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。灵敏度高、特异性强、产率高、重复性好、操作简便、快速 循环次数取决于模板DNA的浓度 30次扩增100万倍 PCRu理论扩增率： 2n递增（n为循环次数）， 2530循环，目标DNA可增加10 倍。9u实际扩增率：() ，X为PCR的

14、实际扩增率，n平均约为75%。u由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行 30个循环后，扩增倍数一般可达106107。u以“变性、退火、延伸”三部曲为 PCR一轮循环。 DNA测序技术的历史第一代DNA测序技术三测序方法的原理第二代DNA测序技术三个测序平台的工作原理及操作步骤第三代DNA测序技术单分子测序的特点及应用前景自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。 1998 2000 2001 200220042006 200720082009 201020112012 DNA测序技术的诞生和发展DN

15、A测序技术的诞生（第一代DNA测序技术）v 1977年，英国剑桥医学研究会的分子生物学实验室Frederick Sanger发明双脱氧链终止法DNA测序技术(Sanger和Coulson)v 1977年，美国哈佛大学生化学家Walter Gilbert发明DNA化学降解法测序技术(Maxam 和Gilbert,1977)Ø1980年， Sanger和Gilbert因建立DNA测序技术而获得诺贝尔化学奖（Sanger是第2次获得诺贝尔化学奖） 1、双脱氧链终止法原理：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4种dNTP存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸( ddN

16、TP) ，因为双脱氧核苷没有3 ´-OH，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷,链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3 ´端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳,分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后,根据片段3端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。 用于终止反应的双脱氧核苷酸Ø将2 ，3 双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺乏3 羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。

17、 技术路线与要求A 克隆于质粒中DNA用碱或热变性制备单链模板B M13克隆单链DNAC 噬粒克隆DNA将单链模板与一小段引物退火D PCR产生单链DNA加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP分别加入少量4种双脱氧核苷酸将4种反应产物分别在4条泳道电泳根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 2.化学降解法美国哈佛大学的Maxam和Gilbert于1977年发明的，化学降解法主要用于测定短片段DNA的序列。用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳和放射自显影后，直接

18、读出待测DNA片段的核苷酸顺序。 化学裂解法测定DNA的核苷酸序列 Ø Maxam-Gilber法所能测定的长度要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端 250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。Sanger 法需要单链模板和特异寡核苷酸，并需获得大肠杆菌DNA 聚合酶IKlenow 片段的高质量酶制剂，而Maxam-Gilbert法只需简单化学试剂。Ø 随着M13 噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。Ø 然而，化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：所测序列来自

19、原DNA 分子而不是酶促合成所产生的拷贝。因此，利用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况。Ø 由于Sanger法既简便又快速，因此是现今的最佳选择方案。事实上，目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的。 3、荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger原理，用四种不同的荧光混合物分别标记四种反应的产物，用四种反应物混合在一起进行电泳，在激光的激发下四种带有不同荧光染料标记物的ddNTP可以在同一反应管种进终止测序反应，并于变性的聚丙烯酰胺凝胶的同一泳道中进行电泳检测。当带有某种荧光素标记的DNA片段电泳到激光探头的检测

20、范围时，激光所激发的荧光信号被探测器接受，经计算机分析数据，自动排列出DNA序列。 第一代半自动测序示意图 第一代全自动测序 毛细管电泳测序用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳，可使DNA的测序速度更为迅速。这种电泳装置有96个泳道，每次可同时进行96次测序，每轮实验不到2小时，1天可完成近千次反应。 毛细管电泳测序装置 第一代测序法的比较方法优点缺点双脱氧末端终止法 化学降解法 荧光自动测序技术操作简便，结果清晰可靠，一次能确定300500个核苷酸序不需要进行酶促反应，可以分析 自动化程度高，高甲基化等DNA的 效率，精确度增加列，已成为最常用的修饰情况DNA测序方法一次最多只能分花费时间过久

21、，成本 析250个核苷酸，纯化量小，不能纯化较长的片段较高所用的许多化学试剂有毒 第二代DNA测序技术p二代测序的核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。p第二代测序技术最显著的特征是高通量,一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。p第二代测序技术主要包括罗氏公司的454（GS FLX）测序平台、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台。 1、 Roche 454GS FLX454公司可谓新一代测序技术的奠基人。2005年底，454公

22、司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统Genome Sequencer 20 System，被Nature杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。后来，他们又推出了全新的GS FLX系列试剂和软件的补充，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性、读长也进一步提升。 Roche 454测序原理原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。 乳液PCR（emRCR）每个独特的片段在

23、自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，携带扩增片段的磁珠进入进入反应板。 一个磁珠一条读长Ø放置在单独的试剂瓶里的碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入反应板，每次只进入一个碱基Ø如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。Ø焦磷酸在ATP硫酸化酶和萤光素酶的作用下，将萤光素氧化成氧化萤光素，同时释放出光信号，并被高灵敏度CCD捕获到。 GS FLX测序技术的优点GS FLX系统的测序也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术

24、。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；特点：分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化。 2.Illumina -Solexa Genome AnalyzerSolexa系统应用了边合成边测序（Sequencing BySynthesis）的原理。加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。这些核苷酸是“可逆终止子”，因为3羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。

25、此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。 Solexa测序技术的特点通量高：目前一台机器在两周内最高可产出360G的数据;准确率高：高于98.5% ，同时也有效地解决了多聚重复序列的读取问题;成本低：低于传统Sanger测序技术的成本; 3. ABI SOLiD测序技术SOLiD的独特之处在于以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，可对单拷贝DNA片段进行大规模扩增和高通量并行测序。就通量而言，SOLiD 3系统是革命性的，目前SOLiD 3单次运行可产生50GB的序列数据，相当于17倍人类基因组覆盖度。而其无以伦比的准确性、系统可靠性和可扩展性更让它从其他新一代测序平台中脱颖而出。 三大测序平台的技术特点和差异大约读长(碱基数)平台名称检测方法公司测序方法优点相对局限性样品制备较难；难于在第二代中最高读长；处理重复和同种碱基比第一代的测序通量 多聚区域；试剂冲洗基因组罗氏 测序仪 焦磷酸测230-400光学/454 FLX系统序法大带来错误累积；仪器昂贵HiSeq2illumina可逆链终000/mi 止物和合Seq 成测序法仪器昂贵；用于数据删节和分