基因工程的四部曲

1、基因工程的四部曲基因工程的四部曲 1应用DNA探针技术可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基 因的存在及其完全表达 ()2自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上，属于基因工程 ()3转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗性基因频率增加 ()4国际上大多数国家 都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害 ()5每个普通质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点 ()6 外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制 ()答案1. 2. 3. 4. 5. 6 . 自我检查自我检查1、 基因工程操作步骤：基因工程操作步骤： 。（1）获取目的基因的方法有）获取目的基因的方法有

2、 。（2） 是关键步骤，基因表达载体的组是关键步骤，基因表达载体的组成：成： 。 一、自主导学：一、自主导学：获取目的基因、制备重组获取目的基因、制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）、分子（基因表达载体的构建）、受体细胞的转化与筛选、目的基因的检测与表达受体细胞的转化与筛选、目的基因的检测与表达通过基因文库获取、通过基因文库获取、PCR技术扩增、人工合成（反转录法和化技术扩增、人工合成（反转录法和化学方法合成学方法合成），真核生物常用），真核生物常用 人工合成人工合成 方法方法。基因表达载体的构建基因表达载体的构建目的基因、启动子、终止子和标记基因等目的基因、启动子、终止子和标记基因等（3

3、）受体细胞的转化与筛选：基因工程中常用的受体细胞）受体细胞的转化与筛选：基因工程中常用的受体细胞 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。动物常把等。动物常把 细胞作为受体细胞。导入植物细胞的细胞作为受体细胞。导入植物细胞的方法有方法有 等；农杆菌转化法可以将目的基因导等；农杆菌转化法可以将目的基因导入细胞并把其整合到受体细胞的入细胞并把其整合到受体细胞的 上，导入动物细胞上，导入动物细胞的方法有的方法有 ；如果运载体是质粒，受体细胞是细；如果运载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用菌，一般是将细菌用 处理，以增大细菌处理

4、，以增大细菌 的通透的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于于 ，在很短的时间内就能够获，在很短的时间内就能够获得得 。受精卵受精卵农杆菌转化法农杆菌转化法染色体染色体DNA显微注射法显微注射法CaCl2细胞壁细胞壁细菌繁殖的速度非常快细菌繁殖的速度非常快根据受体种类不同，选择的受体细胞也不同，为根据受体种类不同，选择的受体细胞也不同，为什么？什么？大量的目的基因大量的目的基因（4）、检测目的基因是否进入受体细胞可以用）、检测目

5、的基因是否进入受体细胞可以用 方法，用方法，用 方法检测目的基因是否转录，用方法检测目的基因是否转录，用免疫（免疫（ ）法检测目的基因是否表达。另外也）法检测目的基因是否表达。另外也可进行个体水平检测。如可进行个体水平检测。如 。2、基因拼接成功的原因、基因拼接成功的原因_ 。 转基因表达成功的原因是生物转基因表达成功的原因是生物 。基因工程的意义：基因工程的意义： 。DNA分子杂交分子杂交DNA与与RNA杂交杂交抗原抗体反应抗原抗体反应让虫子啃食棉叶，观察虫子的存活状态让虫子啃食棉叶，观察虫子的存活状态脱氧核苷酸且遵循碱基互补配对原则脱氧核苷酸且遵循碱基互补配对原则共用一套遗传密码共用一套遗

6、传密码目的性强；克服远源杂交不亲和的障碍目的性强；克服远源杂交不亲和的障碍DNA都是双螺旋结构，基本组成单位都是都是双螺旋结构，基本组成单位都是人人( (人胰岛素人胰岛素) )大肠杆菌大肠杆菌( (无胰岛素基因）无胰岛素基因）人的胰岛人的胰岛素基因素基因与载体（与载体（DNA)DNA)结合结合导入导入大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞获取获取分离分离发酵培养发酵培养( (含胰岛素基因含胰岛素基因) )胰岛素胰岛素（抗性检测与鉴定）（抗性检测与鉴定）Insulin（Levemir ）诺和诺德公司研制诺和诺德公司研制 glargine （Lantus）安万特公司研制安万特公司研制胰岛素是治疗糖尿病的特效药，

7、长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，中提取，1000Kg胰腺只能提取胰腺只能提取40-50g的胰岛素，其产量之的胰岛素，其产量之低低和价格之和价格之高高可可想而知。能否想而知。能否用大肠杆菌生产人的胰岛素？如果能，如何实现？用大肠杆菌生产人的胰岛素？如果能，如何实现？1.获取目的基因获取目的基因(1)(1)从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因(2)(2)利用利用PCR(PCR(多聚酶链式反应多聚酶链式反应) )技术扩增目的基因技术扩增目的基因在生物体外复制特定在生物体外复制特定DNADNA片段的核酸合成技术。可

8、以获得大量的目的基因。片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。包括：变性、退火、延伸三部曲包括：变性、退火、延伸三部曲变性变性(95):(95):双链双链DNADNA解旋成为单链解旋成为单链DNADNA退火退火(55):(55):部分引物与模板的单链部分引物与模板的单链DNADNA的特定互补部位相配对和结合的特定互补部位相配对和结合延伸延伸(72):(72):以目的基因为模板，在以目的基因为模板，在DNADNA聚合酶的作用下，合成互补的新聚合酶的作用下，合成互补的新DNADNA链链PCRPCR缓冲溶液中：缓冲溶液中：目的基因、目的基因、4 4种脱氧核苷酸、两种引物、种脱氧核苷酸、两种引物、

9、 耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶、能源物质聚合酶、能源物质(3)(3)人工合成目的基因人工合成目的基因基因比较小，核苷酸序列已知，可以通过基因比较小，核苷酸序列已知，可以通过DNADNA合成仪人工合成合成仪人工合成DNA DNA 二二、理解基因工程的四部曲理解基因工程的四部曲相同点：都由能够编码蛋白质的编码区和具有调相同点：都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区构成。控作用的非编码区构成。不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真核细胞的编码区是间隔的，不连续的。核细胞的编码区是间隔的，不连续的。真核，原核生物基因比较：真核，原核生物基因比

10、较：编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区（能编码蛋白质）（能编码蛋白质）启动子启动子终止子终止子外显子外显子内含子内含子编码蛋白质编码蛋白质（不能编码蛋白质）（不能编码蛋白质）真核生物基因结构真核生物基因结构限制酶限制酶基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装1)1)基因组文库基因组文库(Genomic library) (Genomic library) 是指将某种生物体的是指将某种生物体的全部基因组全部基因组DNADNA用限制性内切酶切割成一定用限制性内切酶切割成一定长度范围的长度范围的DNADNA片段，再与合适片段，再与合适的载体在体外重组后，导入

11、受体的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。生物的全部基因。目的基因的获取目的基因的获取1.1.基因文库基因文库目的基因的获取目的基因的获取cDNAcDNA( (互补互补DNA)DNA)：是由生物的某一特定器官或是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的特定发育时期细胞内的mRNAmRNA经体外逆转录后形成的互补经体外逆转录后形成的互补DNADNA片段，与载体连接后储片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个存在一个受体

12、菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的受体菌群就叫做这种生物的cDNAcDNA文库文库 2)cDNA2)cDNA文库文库 ( (cDNAcDNA library library) )基因重组基因重组逆转录酶逆转录酶mRNAmRNAcDNAcDNA基因的剪刀基因的剪刀 限制性核酸内切酶（分子手术刀）限制性核酸内切酶（分子手术刀）一种酶识别并切割一种特定的核苷酸序列一种酶识别并切割一种特定的核苷酸序列G A A T T CC T T A A GGC T T A AA A T T CG黏性末端黏性末端限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶（1 1）利用限制酶和）利用限制酶和DNADNA连接酶

13、如何构建基因表达载连接酶如何构建基因表达载体？体？2 2、构建基因表达载体、构建基因表达载体单酶切单酶切-先用同一种限制酶目的基因和质粒，再先用同一种限制酶目的基因和质粒，再加入加入DNA连接酶连接酶单酶切单酶切-先用同一种限制酶目的基因和质粒，再先用同一种限制酶目的基因和质粒，再加入加入DNA连接酶连接酶质粒质粒质粒连接物质粒连接物目的基因目的基因-目的基因连接物目的基因连接物目的基因目的基因质粒连接物质粒连接物质粒自身环化质粒自身环化目的基因自身环化目的基因自身环化质粒自身环化质粒自身环化 质粒质粒 目的基因目的基因目的基因自身环化目的基因自身环化质粒质粒质粒质粒目的基因目的基因目的基因目

14、的基因单酶切单酶切 变变 双酶切（用两种酶分别切割目的基因的两端双酶切（用两种酶分别切割目的基因的两端和质粒）和质粒）为了防止目的为了防止目的基因和质粒在基因和质粒在酶切后末端发酶切后末端发生生任意连接任意连接，酶切时应选用酶切时应选用两种酶切割，两种酶切割，从而保证目的从而保证目的基因和载体定基因和载体定向连接向连接。（2 2）目的基因与质粒相互连接成基因表达载体的）目的基因与质粒相互连接成基因表达载体的结构基础是什么？结构基础是什么？AGCTATGC平面结构平面结构双螺旋结构双螺旋结构（3 3）如何针对基因表达载体进行加工和改）如何针对基因表达载体进行加工和改造才能实现目的基因的稳定存在和

15、高效表达？造才能实现目的基因的稳定存在和高效表达？目的：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代使目的基因能表达和发挥作用。使目的基因能表达和发挥作用。复制原点：复制原点：目的基因：目的基因：启动子：启动子：终止子：终止子：标记基因：标记基因：控制合成目的蛋白质控制合成目的蛋白质是是RNA聚合酶识别和结合的聚合酶识别和结合的部位部位,启动基因转录出启动基因转录出mRNA终止转录终止转录鉴别与筛选导入目的基因鉴别与筛选导入目的基因的受体细胞的受体细胞组成组成标记基因一定标记基因一定是抗性基因吗？是抗性基因吗？DNA的复制的的复制的起始

16、起始位点位点 标记基因用于检测标记基因用于检测目的基因是否导入目的基因是否导入成功的原理是什么？成功的原理是什么？启动子与起始密码、终止子与终止密码一样吗？启动子与起始密码、终止子与终止密码一样吗？编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子终止子终止子编码蛋白质编码蛋白质起始密码起始密码终止密码终止密码mRNA启动子(DNA片段)起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)终止密码子(RNA)3、受体细胞的转化与筛选受体细胞的转化与筛选思考：受体细胞的类型？转化方法？为什么需思考：受体细胞的类型？转化方法？为什么需要筛选？如何筛选？要筛选？如何筛选？筛选重组细胞筛选重组细胞(1)筛

17、选的原因：不是所有的受体细胞接纳了重组筛选的原因：不是所有的受体细胞接纳了重组DNA分子，只有部分受分子，只有部分受体细胞中含有目的基因。体细胞中含有目的基因。(2)筛选的方法：利用标记基因。筛选的方法：利用标记基因。 DNA分子分子 目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定基因基因结构结构原核生物原核生物 真核生物真核生物方法方法从基因文库中获取从基因文库中获取人工合成人工合成PCR技术扩增技术扩增 DNA复制复制操作工具操作工具组成过程限制酶DNADNA连接酶连接酶载体载体目的基因+

18、启动子+终止子+标记基因+复制原点导入植物细胞导入植物细胞导入动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞DNA结构结构基因工程应用基因工程应用转基因动物、转基因动物、植物、微生物植物、微生物基因工程药物基因工程药物基因诊断、基基因诊断、基因治疗因治疗转基因食品、转基因食品、生物的安全性生物的安全性发展发展蛋白质工程蛋白质工程基因工程知识联系不同来源不同来源DNADNA重新组重新组合的过程合的过程实质基因重组基因重组优点：优点：定向改造定向改造典例分析典例分析（选修模块（选修模块3：现代生物科技专题）：现代生物科技专题）图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶图为某种质粒表达

19、载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，为青霉素抗性基因，tctR为四环为四环素抗性基因，素抗性基因，P为启动因子，为启动因子，T为终止子，为终止子，ori为复制原点。已知目为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点在内的多种酶的酶切位点。（1）将含有目的基因的）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切，酶切产物用酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连片段之间连接形成的产

20、物有接形成的产物有 、 、 三种。若要从这些连接产物三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行 。目的基因目的基因载体连接物载体连接物目的基因目的基因-目的基因连接物目的基因连接物分离纯化分离纯化载体载体-载体连接物载体连接物青霉素抗性基因青霉素抗性基因四环素抗性基因四环素抗性基因（2 2）用上述）用上述3 3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有接种到含四环的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是的连接产物是 ； 若接种到含青霉素的培

21、养基中，能生长的原核宿主细胞所若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是含有的连接产物是 。（3 3）目的基因表达时，）目的基因表达时，RNARNA聚合酶识别和结合的位点是聚合酶识别和结合的位点是 ，其合成的产物是，其合成的产物是 。（4 4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是是_。载体载体-载体连接物载体连接物载体载体-载体连接物载体连接物目的基因目的基因-载体连接物载体连接物启动子启动子mRNAEcoRI和和Bam

22、HI青霉素抗性基因青霉素抗性基因四环素抗性基因四环素抗性基因例题：例题：（9分）下图是利用生物工程技术生产人生长激素的示意图。质粒上分）下图是利用生物工程技术生产人生长激素的示意图。质粒上的的Ampr表示青霉素抗性基因，表示青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因，限制酶表示四环素抗性基因，限制酶PstI、EcoR I和和Hind 切割形成的末端均不相同。据图回答：切割形成的末端均不相同。据图回答：（1）将人生长激素基因导入小鼠体内来生产生长激素。图中）将人生长激素基因导入小鼠体内来生产生长激素。图中对供体雌鼠甲用促对供体雌鼠甲用促性腺激素处理一段时间后与雄鼠乙交配，然后通过手术的方法从雌鼠甲的性腺激素处理一段时间后与雄鼠乙交配，然后通过手术的方法从雌鼠甲的_中取出受精卵。图中早期胚胎应保证发育到中取出受精卵