蛋白质含量测定总结报告

1、动力组合动力组合组员：柴鲜鲜、王锦、组员：柴鲜鲜、王锦、 安艳松、蒋玉丹安艳松、蒋玉丹测定方法测定方法n微量凯氏（微量凯氏（KjeldahlKjeldahl）定氮）定氮法法n双缩脲法（双缩脲法（BiuretBiuret法）法）nFolinFolin酚试剂法（酚试剂法（LowryLowry法）法）n考马斯亮兰法（考马斯亮兰法（BradfordBradford法）法）n紫外吸收法紫外吸收法标准曲线标准曲线实验结果实验结果n称量豆芽0.2g和2gn样液的吸光度分别为0.118、0.253和0.110n分别在标准曲线上查的蛋白质含量为15、50和14n算出样品中含有的蛋白质分别为5100、19125、

2、535.5 内内 容容 导导 览览蛋白质的定义及组成蛋白质的定义及组成氨基酸的概述氨基酸的概述蛋白质的介绍蛋白质的介绍蛋白质的应用蛋白质的应用元素组成：元素组成：n元素组成：元素组成：C C、H H、O O、N N、S S、P P除除此之外还含有微量金属此之外还含有微量金属FeFe、CuCu、MnMn、ZnZn、CoCo等，个别的有非金属。等，个别的有非金属。n蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点 蛋白质的含氮量平均为蛋白质的含氮量平均为16。蛋白质含量。蛋白质含量氮含量氮含量6.25凯氏定氮法测定蛋白质含量的凯氏定氮法测定蛋白质含量的理论依据理论依据蛋白质结构的基本单位蛋白质结构的基本单

3、位氨氨基酸基酸n化学结构属化学结构属L-L-型型氨基氨基酸（甘氨酸酸（甘氨酸除外）除外）n氨基酸的结氨基酸的结构通式构通式2.氨基酸的分类分类依据分类依据分分 类类R R基结构基结构脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸、杂环族氨脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸、杂环族氨基酸基酸R R基酸碱性基酸碱性酸性氨基酸、碱性氨基酸、中性氨基酸酸性氨基酸、碱性氨基酸、中性氨基酸人体内能否自己合成人体内能否自己合成必需氨基酸、非必需氨基酸必需氨基酸、非必需氨基酸分解产物进一步转化分解产物进一步转化生糖氨基酸、生酮氨基酸、生糖兼生酮氨生糖氨基酸、生酮氨基酸、生糖兼生酮氨基酸基酸是否用于合成蛋白质是否用于合成蛋白质标准氨基酸、

4、非标准氨基酸标准氨基酸、非标准氨基酸有无遗传密码有无遗传密码编码氨基酸、非编码氨基酸编码氨基酸、非编码氨基酸1.1.非极性疏水非极性疏水R R基氨基基氨基酸酸2.2.极性不带电荷氨基极性不带电荷氨基酸酸3.3.带正电荷带正电荷R R基氨基酸基氨基酸4.4.带负电荷带负电荷R R基氨基酸基氨基酸氨基酸可根据氨基酸可根据R R基结构和理化性质进行分类基结构和理化性质进行分类1. 非极性疏水非极性疏水R基氨基酸基氨基酸(一一)1. 非极性疏水非极性疏水R基氨基酸基氨基酸(二二)( (甲硫氨酸甲硫氨酸) )2. 极性不带电荷极性不带电荷R基氨基酸基氨基酸Tyr3. 带正电荷带正电荷R基氨基酸基氨基酸(

5、碱性氨基酸碱性氨基酸)Page 144. 带负电荷带负电荷R基氨基酸基氨基酸(酸性氨基酸酸性氨基酸)(zwitterion)pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性离子氨基酸的兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子CHNH2COOHR CHNH2COOHRCHNH3+COO-R CHNH3+COO-RCHNH2COO-R CHNH2COO-RCH COOHRNH3+CH COOHRNH3+三、氨基酸的理化性质三、氨基酸的理化性质1 1、两性解离、两性解离pH pI正电荷正电荷 两性离子两性离子 负电荷负电荷负极移动（电场中）负极移动（电场中） 不移动不移动 正极移动正极移动

6、n等电点（isoelectric point, pI）：在某一pH环境中，氨基酸解离成阳性离子及阴性离子的趋势相等，所带净电荷为零，在电场中不泳动。此时，氨基酸所处环境的pH值称为该氨基酸的等电点。紫外吸收：紫外吸收：nTrp、Tyr和和Phe在在280nm波波长附近具有最大长附近具有最大吸收峰，其中吸收峰，其中Trp的最大吸收的最大吸收最接近最接近280nm3、显色反应：、显色反应：（1）茚三酮反应）茚三酮反应氨基酸与茚三酮水合物共热，生成蓝紫色化合物，其最氨基酸与茚三酮水合物共热，生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰为大吸收峰为4 470nm70nm，可用于氨基酸定量分析。，可用于氨基酸定量分析

7、。 用过量的中性甲醛与氨基酸反应，可游离出氢离子，用过量的中性甲醛与氨基酸反应，可游离出氢离子，然后用然后用NaOHNaOH滴定，从消耗的碱量可以计算出氨基酸的滴定，从消耗的碱量可以计算出氨基酸的含量。此法称为间接滴定法。含量。此法称为间接滴定法。(2) (2) 与甲醛的反应与甲醛的反应Sanger 反应 2.42.4一二硝基氟苯（一二硝基氟苯（DNFBDNFB）DNP-DNP-氨基酸，黄色，层析法鉴定，氨基酸，黄色，层析法鉴定， 被被SangerSanger用来测定多肽的用来测定多肽的NHNH2 2末端氨基酸末端氨基酸 Edman反应异硫氰酸苯酯，异硫氰酸苯酯，PITC PITC 苯乙内酰硫

8、脲衍生物苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-PTH-氨基酸），无氨基酸），无色，可以用层析法分色，可以用层析法分离鉴定。离鉴定。被被EdmanEdman用来鉴定多用来鉴定多肽的肽的NHNH2 2末端氨基酸末端氨基酸 蛋白质的分子结构包括蛋白质的分子结构包括一级结构一级结构(primary structure)二级结构二级结构(secondary structure)三级结构三级结构(tertiary structure)四级结构四级结构(quaternary structure)高级高级结构结构一、一级结构一、一级结构1 1、定义：、定义：蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺

9、序( (含二硫键含二硫键) )。基本概念基本概念* 肽键肽键(peptide bond)(peptide bond)是由一个氨基是由一个氨基酸的酸的 - -羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的 - -氨氨基脱水缩合而形成的化学键。基脱水缩合而形成的化学键。肽与肽键肽与肽键NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH-CH-CHOHO OH甘甘氨氨酸酸+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键NH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH2-CH-C-N-CH-COOHHHHO生物活性肽生物活性肽：n谷胱甘肽谷胱甘肽n神经肽：脑啡肽、内神经肽：脑啡肽、内啡肽、强

10、啡肽、啡肽、强啡肽、P物质、物质、Y肽肽n肽类激素：催产素、肽类激素：催产素、加压素等加压素等n其他：生长因子；短其他：生长因子；短杆菌杆菌S；甜味肽等；甜味肽等 维持蛋白质分子构象的化学键维持蛋白质分子构象的化学键二、二级结构二、二级结构2 2、二级结构存在的形式与特点、二级结构存在的形式与特点 多肽主链按右手或左多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，蛋白质中旋或左手螺旋，蛋白质中的的-螺旋几乎都是右手，螺旋几乎都是右手，右手螺旋比左手螺旋稳定。右手螺旋比左手螺旋稳定。 相邻的螺圈之间形成相邻的螺圈之间形成链内氢键。链内氢键。（1 1） -螺旋螺旋 典型

11、的典型的-螺旋有如下螺旋有如下特征：特征：每圈螺旋：每圈螺旋：3.63.6个个a.aa.a残残基；高度：基；高度：0.54nm 0.54nm 每个残基绕轴旋转每个残基绕轴旋转100100, ,沿轴上升沿轴上升0.15nm0.15nm。氨基酸残基侧链向外。氨基酸残基侧链向外。相邻螺圈之间形成链内相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。与中心轴平行。肽键上肽键上C=OC=O氧与它后面氧与它后面（C C端）第四个残基上的端）第四个残基上的N-HN-H氢间形成氢键。氢间形成氢键。（2）-折叠折叠 两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同肽段）侧向聚集在一两条或

12、多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的起，相邻肽链主链上的NHNH和和C=0C=0之间形成氢链，这样的多肽构象就是之间形成氢链，这样的多肽构象就是-折叠片。折叠片。氢键氢键:与与肽 链 的肽 链 的长 轴 接长 轴 接近垂直近垂直。多肽主链多肽主链:呈锯齿状折叠构呈锯齿状折叠构象象侧链侧链R基交替地分布基交替地分布在片层平面的两侧在片层平面的两侧反平行式：反平行式：肽链的极性肽链的极性一顺一倒，一顺一倒，N端间隔相端间隔相同同. 反平反平-折叠比平行折叠比平行的更稳定的更稳定 - -转角转角一般由四个氨基酸组成，一般由四个氨基酸组成，常见氨基酸：常见氨

13、基酸：Pro,Gly以主链间氢键维持稳定。以主链间氢键维持稳定。多肽链中多肽链中180180度回折处度回折处形成的特定构象。形成的特定构象。没有确定规律性的肽链结构，存在于球状蛋没有确定规律性的肽链结构，存在于球状蛋白质中。（常常是酶的功能部位）白质中。（常常是酶的功能部位） 三、三级结构三、三级结构 1、定义：整个多肽定义：整个多肽链在二级结构、超链在二级结构、超二级结构和结构域二级结构和结构域的基础上盘旋、折的基础上盘旋、折叠，形成的特定的叠，形成的特定的整个空间结构。整个空间结构。（四）、蛋白质的四级结构（四）、蛋白质的四级结构n亚基亚基(subunit)：寡聚蛋白中的单条独立的多肽链，

14、具有：寡聚蛋白中的单条独立的多肽链，具有独立的一、二、三级结构，单独存在时一般无生物学活性。独立的一、二、三级结构，单独存在时一般无生物学活性。亚基之间以非共价键联系，亚基可以相同或不同。亚基之间以非共价键联系，亚基可以相同或不同。n亚基之间以非共价键联系，包括疏水键（主要）、盐键、亚基之间以非共价键联系，包括疏水键（主要）、盐键、氢键、范德华力氢键、范德华力n亚基可以相同或不同亚基可以相同或不同蛋白质分子中的结构层次蛋白质分子中的结构层次一级结构一级结构二级结构二级结构超二级结构超二级结构结构域结构域三级结构三级结构亚基亚基 四级结构四级结构蛋白质一级结构是空间结构和生蛋白质一级结构是空间结

15、构和生物功能的基础，一级结构决定空物功能的基础，一级结构决定空间结构；但一级结构并非决定空间结构；但一级结构并非决定空间结构的唯一因素。空间结构是间结构的唯一因素。空间结构是生物活性的直接体现。生物活性的直接体现。1 1、蛋白质的两性电离蛋白质的两性电离 理化性质理化性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pHpH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当

16、蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。2 2、蛋白质的紫外吸收、蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收波长处有特征性吸收峰。蛋白质的峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。此可作蛋白质定量测定。 3.蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 蛋白质分

17、子直径在蛋白质分子直径在1-100nm1-100nm之间，在水溶之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜，吸附能力等）。象，不能通过半透膜，吸附能力等）。 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素：稳定蛋白质胶体溶液的主要因素： 1 1、蛋白质表面极性基团形成的水化膜。、蛋白质表面极性基团形成的水化膜。 2 2、非等电状态时，同种电荷的互相排斥。、非等电状态时，同种电荷的互相排斥。 3 3、质点大小在、质点大小在1-100nm1-100nm，可以进行布郎运动，可以进行布郎运动 4 4、蛋白质的沉淀反应、蛋白质的沉淀反应 1 1、 盐

18、析：当离子强度增加到足够高、达到饱和或半饱和程度时蛋白质从盐析：当离子强度增加到足够高、达到饱和或半饱和程度时蛋白质从溶液中沉淀出来的现象。溶液中沉淀出来的现象。 2 2、有机溶剂沉淀法、有机溶剂沉淀法 水化膜，降低介电常数，如水化膜，降低介电常数，如PEGPEG、丙酮、乙醇丙酮、乙醇 3 3、重金属盐沉淀、重金属盐沉淀 pHpHpIpI时带负电荷，与重金属离子时带负电荷，与重金属离子HgHg2+2+. Pb. Pb2+2+. Cu. Cu2+2+等等 结成不溶性沉淀。结成不溶性沉淀。 4 4、有机酸沉淀法、有机酸沉淀法 pHpH小于等电点时，蛋白质带正电荷，易有机酸的负离子生小于等电点时，蛋

19、白质带正电荷，易有机酸的负离子生 成不溶性沉淀。如单宁酸、苦味酸、钨酸、三氯乙酸、磺基水杨酸成不溶性沉淀。如单宁酸、苦味酸、钨酸、三氯乙酸、磺基水杨酸 5.蛋白质的变形 概念：概念：在某些理化因素作用下，蛋白质的空间构象在某些理化因素作用下，蛋白质的空间构象破坏，导致若干理化性质和生物学性质的改变。破坏，导致若干理化性质和生物学性质的改变。 变性因素：变性因素：1 1）物理因素：高温、高压、射线等）物理因素：高温、高压、射线等2 2）化学因素：强酸、强碱、重金属盐等）化学因素：强酸、强碱、重金属盐等 变性后的表现：变性后的表现：1 1）生物学活性消失）生物学活性消失2 2）理化性质改变）理化性质改变 6.6.蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应 1 1、双缩脲反应、双缩脲反应 双缩脲：双缩脲： O OO O H2NC