菠萝蜜EST—SSR标记开发及其种质资源遗传多样性分析.doc

1、菠萝蜜ESTSSR标记开发及其种质资遗传多样性分析p 打开文本图片集【摘要】：p 目的分析p 菠萝蜜EST-SSR标记的稳定性和多态性揭示能力，并将其用于菠萝蜜种质资遗传多样性研究。方法利用已获得的菠萝蜜cDNA文库中的EST 序列，通过搜索SSR序列，设计引物，PCR扩增后，银染检测扩增结果。结果设计开发出479对EST-SSR引物，其中399对能在菠萝蜜上扩增出产物，282对具有多态性，多态性扩增引物占58.87；从中选择60对能够清晰扩增的多态性引物，对64份菠萝蜜种质资进行遗传多样性分析p ，60对EST-SSR引物共扩增出188条带，不同引物的扩增条带数在211，平均3.13条；其中

2、有168条为多态性条带，多态率为89.36；每对引物的多态信息含量（PIC）为 0.40770.9589，平均PIC为0.7922，这说明供试材料具有较高的遗传多样性。系统聚类分析p 结果表明，在相似系数0.6881处，可将64份菠萝蜜种质资分成二大类群，在相似系数0.7325处，第二大类群又可分为4个亚群。结论EST-SSR 标记的多态性揭示能力强，用于分析p 菠萝蜜种质遗传多态性的能力强，其应用前景广阔。【关键词】：p 菠萝蜜；EST-SSR；遗传多样性；种质资中图分类号 S602文献标识码 A文章编号 0517-6611（20_）11-135-05菠萝蜜（Artocarpus heter

3、ophyllus Lam.），又称木菠萝、树菠萝等，属于桑科菠萝蜜属植物，起于印度，引入我国已有1400多年的历史1，在我国广东、广西、四川、海南和云南等地均有栽培2。近年来，随着菠萝蜜经济价值和用途越来越多地被人们所发现和重视，菠萝蜜种植面积不断扩大，对菠萝蜜新品种的需求也日益强烈。分子标记是当前广泛用于农作物新品种选育的重要辅助手段，但在菠萝蜜中可利用的分子标记还很少。EST（E_pressed Sequence Tag）是由cDNA文库克隆、测序获得的序列，属于基因编码区。EST-SSR标记是在EST序列的基础上，通过搜索SSR序列，根据其两侧的序列设计引物开发的一种分子标记。EST-S

4、SR标记的开发避免了SSR开发的高成本、耗力耗时3等缺点，却延续了SSR标记的典型优点，即多态性高、重复性好、共显性标记4等。由于EST序列来于基因编码区，与基因功能有关且高度保守，因此，EST-SSR标记可直接鉴定表达重要农艺性状的基因，且在种间具有高度通用性。近年来，鉴于EST-SSR标记的各种优点，EST-SSR标记被广泛应用于作物种质资的遗传多样性分析p 和亲缘关系鉴定，如小麦5、棉花6、辣椒7、梨8、荔枝9、越橘10等，但在菠萝蜜中鲜见报道。笔者在测序获得的菠萝蜜EST序列基础上，分析p SSR序列特征并用以开发EST-SSR标记，并将其用于菠萝蜜种质遗传多样性分析p ，以期为进一步

5、开展种质鉴定、基因定位、图谱构建等提供有力工具。1 材料与方法1.1 试验材料从广东海洋大学菠萝蜜种质资圃随机选取64份菠萝蜜种质，这64份种质主要来自雷州半岛、海南和云南等地，只有小部分来自马来西亚、巴基斯坦等国。采集种质的新鲜叶片，于-80 冰箱保存备用。1.2 方法1.2.1 基因组总DNA提取与检测。液氮磨样后，利用改良的CTAB大量法11提取基因组DNA，RNase A消化其中的RNA后，进行精提取，DNA沉淀用1×TE溶解，-20 保存备用。提取的DNA样品使用0.8琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA的质量和纯度。1.2.2 EST-SSR引物开发。从NCBI中搜索

6、并下载菠萝蜜的EST序列，外加已获得的菠萝蜜EST序列，通过MISA软件搜索SSR序列，再利用Primer 3.0 Plus软件设计SSR引物，委托北京鼎国生物科技有限公司合成。1.2.3 EST-SSR引物扩增与筛选。从64份种质中选取8份形态性状明显差异的种质进行PCR扩增，筛选出能扩增出明显条带的引物。PCR扩增反应体系为20 L，其中，DNA模板2 g/mL，dNTPs溶液2 mmol/L，Taq酶50 U/mL，Mg2+溶液2 mmol/L，引物0.2 mol/L，1×Taq酶Buffer溶液，用去离子水定容至20 L。PCR反应程序：94 预变性5 min；94 变性30

7、 s，55 退火30 s，72 延伸40 s，35个循环；72 延伸10 min，4 保存。PCR反应产物经6的非变性聚丙烯酰胺凝胶（）电泳后，用0.2的AgNO3染色，含NaOH的甲醛溶液显色。1.2.4 遗传多样性分析p 。从可扩增出清晰条带的EST-SSR引物中，随机选择60对引物，对收集的64份菠萝蜜种质进行遗传多样性分析p 。PCR反应体系及扩增程序同“1.2.3”。1.3 数据分析p 统计EST-SSR标记的带型，有带记为“1”，无带记为“0”，空缺记为“”。针对每对SSR引物，只读其典型的共显性SSR主带（图1a和1b）；对于不存在共显性2条带型的，即读扩增出来的所有带（图1c）

8、。统计所扩增的条带总数、多态性条带数，并计算多态性条带所占比例和每个引物的多态信息含量（PIC）。利用NTSYSpc-Version 2.02j软件处理“1、0”数据，首先用Similarity程序获得相似系数矩阵，再利用UPGMA法进行聚类分析p ，获得64份种质的亲缘关系树状图。2 结果与分析p 2.1 菠萝蜜EST-SSR引物的筛选从菠萝蜜EST序列共设计479对EST-SSR引物，其中有80对引物未扩增出PCR产物，能扩增出产物的引物399对，占83.30。在能扩增出产物的引物中，有117对引物所扩增出的PCR产物无多态性，多态性引物282对，所占比例为58.87。这说明由菠萝蜜EST

9、序列开发出的EST-SSR标记在菠萝蜜DNA中有很好的扩增效果。2.2 菠萝蜜EST-SSR标记的多态性从282对多态性引物中选择60对能够扩增出条带清晰、多态性高、易统计的引物，对64份菠萝蜜种质进行遗传多样性分析p 。扩增结果见图1和表1。60对引物共扩增出188条带，平均每个引物能扩增3.13条带，不同引物扩增的条带数在211，其中168条带具有多态性，多态率为89.36。每对引物的PIC为0.407 70.958 9，平均PIC为0.792 2，明显大于0.500 0，这说明EST-SSR在64份菠萝蜜种质上具有较高的遗传多样性揭示能力。44卷11期顾洪涛等 菠萝蜜EST-SSR标记开

10、发及其种质资遗传多样性分析p 2.3 菠萝蜜种质的聚类分析p 利用NTSYSpc-Version 2.02j软件对64份菠萝蜜种质进行聚类分析p ，构建其亲缘关系树状图（图2）。由图2可知，60对EST-SSR引物扩增出的168条多态性条带能够将64份菠萝蜜种质资区分归类，种质之间的遗传相似系数在0.688 10.994 7，平均相似系数为0.841 4，这说明64份菠萝蜜种间亲缘关系较近。在相似系数0.688 1处，该64份种质可分为两大组，第一组全部为干苞，第二组既有干苞，又有湿苞（13、25、31和32即为湿苞）。在相似系数0.732 5处，第二组又可分为4个亚组，4个亚组中干、湿苞仍未

11、各自独立聚为一类，这说明干、湿苞不能在DNA水平上完全分开。5和14号、10和11号的相似系数为0.994 7，这说明5和14、10和11号菠萝蜜种质很可能来于同一亲本或起于同一地区。3 讨论虽然分子标记技术较为成熟，并被广泛应用于作物种质资遗传多样性分析p 、基因组比较、遗传图谱构建、基因组关联分析p 及QTL定位等，但在菠萝蜜遗传分析p 中的应用较少，主要是AFLP、ISSR、RAPD等。王艳红12利用磁珠法发掘菠萝蜜SSR分子标记，但效率偏低。EST-SSR标记由cDNA文库中的EST序列设计而来，开发成本低，在种质资遗传分析p 方面具有独特的优越性，而且其呈现的是基因编码区变异，是功能

12、基因的直接鉴定与评价。在该研究中，由菠萝蜜EST序列设计出的479对SET-SSR引物中，能有效扩增出PCR产物的引物有399对，有效扩增率为83.30，其中能产生多态性扩增产物的引物有282对，多态性扩增率为58.87，高于董清华等13开发的草莓EST-SSR标记的多态性扩增率53.00，显著高于Eujayl等14开发的小麦EST-SSR标记的多态性扩增率16.00。这表明由菠萝蜜EST序列开发SSR标记具有较高的效率。从多态性扩增引物中选择清晰易读的EST-SSR引物60对，对64份菠萝蜜种质进行遗传多样性分析p 。结果表明，60对引物共扩增出188条带，其中具有多态性的条带数为168，占

13、89.36，显著高于Li等15利用AFLP对50份菠萝蜜种质分析p 的20.3，高于叶春海等16利用RAPD对雷州半岛菠萝蜜种质分析p 的88.4。每对引物的PIC在0.40770.9589，平均PIC为0.7922，明显大于0.5000，这表明EST-SSR标记应用于菠萝蜜研究不仅可行，还具有较高的多态性揭示能力。该研究聚类结果仍未能将菠萝蜜干、湿苞分开，这与王耀辉17的研究结果一致。但聚类分析p 所获得的遗传相似系数在0.688 10.994 7，平均相似系数为0.841 4，高于王耀辉17利用ISSR标记分析p 78份菠萝蜜种质的相似系数0.502 30.944 7和平均相似系数0.76

14、6 6，还高于王艳红12对菠萝蜜种质聚类分析p 的相似系数0.576 30.965 5和平均相似系数0.814 0。这可能是因为64份菠萝蜜种质资亲缘关系较近，但也不能排除是因为EST-SSR标记来于cDNA文库所致。cDNA文库中的序列来自高度保守的基因编码区，正因高度保守，在植物进化过程中，发生突变的概率相对较小，基因间差异也较小。4 结论菠萝蜜的EST-SSR 标记是一种高效的功能性标记，其引物开发设计过程简单、省时省力，PCR扩增条带清晰、效果稳定，适用于菠萝蜜种质资之间的遗传多样性分析p 。该研究由EST设计开发的60对EST-SSR引物不仅能扩增出清晰的条带，且64份种质的遗传多样

15、性聚类分析p 结果体现出较高的多态性揭示能力。因此，随着EST数据库中EST序列的丰富，EST-SSR标记被越来越多地应用于菠萝蜜种质资研究，为促进菠萝蜜种质资的创新利用和遗传改良奠定基础。【参考文献】：p 1 潘志刚，游应天.中国主要外来树种引种栽培M.北京：北京科学技术出版社，1994.2 李映志，叶春海，丰锋，等.雷州半岛菠萝蜜种质资研究J.湖南农业大学学报（自然科学版），20_7，33（2）：-186.3 欧良喜，向旭，狄凤香，等.SSR分子标记在荔枝上的研究进展J.生物技术通报，2021，64（S1）：83-87.4 黄启星，左娇，孔华，等.11种热带植物EST-SSR 标记的开发和

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