4 第四章 微生物发酵技术

1、现代微生物学技术Tel:mail: 1淮海工学院海洋学院淮海工学院海洋学院0-101001 1绪论绪论2 22 2微生物资源开发和菌株选育微生物资源开发和菌株选育4 43 36 64 46 65 54 46 6环境微生物技术环境微生物技术6 67 7农业微生物生物技术农业微生物生物技术 4 42淮海工学院海洋学院主要内容1 微生物工艺优化的实验设计微生物工艺优化的实验设计2 发酵过程动力学的基本概念发酵过程动力学的基本概念3 发酵过程的代谢控制发酵过程的代谢控制4 微生物发酵过程工艺参数控制微生物发酵过程工艺参数控制3淮海工学院海洋学院1 微生物工艺优化的实验设计 1

2、.1 微生物发酵工艺的特点 1.2 试验设计中常用的术语 1.3 工艺优化的方法和策略4淮海工学院海洋学院1.1 微生物发酵工艺的特点 应先因素众多 缺乏理论模型 试验误差较大 影响因素间存在相互作用5淮海工学院海洋学院1.2 试验设计中常用的术语 因素：试验中考察的对试验指标可能有影响的因素简称因素。 水平：每个因素在试验中要比较的具体条件称为水平。6淮海工学院海洋学院1.3常用的优化方法 工艺优化研究的主要步骤：筛选：因素多，不精确的知识，找出重要的影响因素；优化：因素少，在较适范围内，建立预言性模型确证：使用预言的最优成套条件，验证结果7淮海工学院海洋学院常用的优化方法 单因子法：实验室

3、最常用的优化方法是单次单因子(one-variable-at-a-time)法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 8淮海工学院海洋学院 多因子试验 多因子试验需要解决的两个问题:(1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。(2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变

4、量进行优化9淮海工学院海洋学院正交实验设计 正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。 正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步：（1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表；（2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验；（3）根据正交表给出的实验方案，进行实验；（4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。 正交方法可以用来分析因素之间的交叉效应，但需要提前考虑那些因素之间存在交互作用，再

5、根据考虑来设计实验。因此，没有预先考虑的两因素之间即使存在交互作用，在结果中也得不到显示。 对于多因素、多水平的科学试验来说，正交法需要进行的次数仍嫌太多，在实际工作中常常无法安排，应用范围受到限制。10淮海工学院海洋学院均匀实验设计 如果仅考虑“均匀分散”，而不考虑“整齐可比”，完全从“均匀分散”的角度出发的实验设计，叫做均匀设计。 均匀设计按均匀设计表来安排实验，均匀设计表在使用时最值得注意的是均匀设计表中各列的因素水平不能像正交表那样任意改变次序，而只能按照原来的次序进行平滑，即把原来的最后一个水平与第一个水平衔接起来，组成一个封闭圈，然后从任一处开始定为第一个水平，按圈的原方向和相反方

6、向依次排出第二、第三水平。 均匀设计只考虑试验点在试验范围内均匀分布，因而可使所需试验次数大大减少。11淮海工学院海洋学院Plackett-Burman法 Plackett-Bunnan设计法是一种两水平的实验优化方法，它试图用最少的实验次数达到使因子的主效果得到尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因子中快速有效地筛选出最为重要的几个因子，供进一步优化研究用。 该法不能考察各因子的相互交互作用。12淮海工学院海洋学院部分因子设计法 部分因子设计法与Plackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。 根据实验

7、数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。13淮海工学院海洋学院响应面分析（response surface analysis，RSM） 方法是数学与统计学相结合的产物，和其他统计方法一样，由于采用了合理的实验设计，能以最经济的方式，用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究，科学地提供局部与整体的关系，从而取得明确的、有目的的结论。 它与“正交设计法”不同，响应面分析方法以回归方法作为函数估算的工具，将多因子实验中，因子与实验结果的相互关系，用多项式近似，把因子与实验结果（响应值）的关系函数化，依此可对函数的面进行分析，研究因子与响应值之间，因子与

8、因子之间的相互关系，并进行优化。14淮海工学院海洋学院2 发酵过程动力学的基本概念发酵过程动力学的基本概念2.1 发酵过程的反应描述及速度概念发酵过程的反应描述及速度概念2.2 发酵过程动力学研究的基本内容发酵过程动力学研究的基本内容2.3 微生物生长动力学的基本概念微生物生长动力学的基本概念2.4 菌体生长、产物形成、基质消耗动力学的基本菌体生长、产物形成、基质消耗动力学的基本概念概念2.5 反应动力学的应用反应动力学的应用连续培养的操作特性连续培养的操作特性15淮海工学院海洋学院 XS（底物）底物） X（菌体）菌体） P（产物）产物）发酵研究的内容：发酵研究的内容：发酵过程反应的描述菌种的

9、来源菌种的来源找到一个好的菌种找到一个好的菌种发酵过程的工艺控制发酵过程的工艺控制最大限度发挥菌种的潜力最大限度发挥菌种的潜力2.1 发酵过程的反应描述及速度概念发酵过程的反应描述及速度概念16淮海工学院海洋学院基质的消耗速度：基质的消耗速度：dsrdt dsdt X X发酵过程反应速度的描述基质的消耗基质的消耗比速比速：(g.L-1.s-1)(h-1、s-1)单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物（菌体）的量称单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物（菌体）的量称为为比速比速，是生物反应中用于描述反应速度的常用概念。，是生物反应中用于描述反应速度的常用概念。 XS（底物）底物） X（菌体）菌体）

10、P（产物）产物）17淮海工学院海洋学院dsdt X X基质的消耗比速：基质的消耗比速：(h-1)菌体的生长比速：菌体的生长比速：dxdtX X产物的形成比速：产物的形成比速：dpdtX X(h-1)(h-1) XS（底物）底物） X（菌体）菌体） P（产物）产物）18淮海工学院海洋学院研究反应速度及其影响因素并建立反应速度与影响因素的关联反应动力学模型反应器特性反应器特性+反应器的操作模型操作条件与反应结果的关系，定量地控制反应过程2.2 发酵反应动力学的研究内容19淮海工学院海洋学院已已建立动力学模型的类型建立动力学模型的类型q 机制模型：机制模型：根据反应机制建立根据反应机制建立几乎没有几

11、乎没有q 现象模型（经验模型）：现象模型（经验模型）：目前大多数模型目前大多数模型 能定量地描述发酵过程能定量地描述发酵过程 能反映主要因素的影响能反映主要因素的影响20淮海工学院海洋学院2.3.1 微生物在一个密闭系统中的生长情况：微生物在一个密闭系统中的生长情况：时间菌体浓度菌体浓度延迟期延迟期指数生长期指数生长期减速期减速期静止期静止期衰亡期衰亡期延迟期延迟期：dxdt0 0指数生长期指数生长期: :mma ax x倍增时间倍增时间：td减速期减速期: :ddt 0 0静止期：静止期： ; ;dxdt0 0maxmaxXXXX衰亡期:dxdt0 02.3 微生物生长动力学的基本概念微生物

12、生长动力学的基本概念21淮海工学院海洋学院2.3.2 微生物的生长动力学、Monod方程q 微生物的生长速度：微生物的生长速度： f(s,p,T,pH,)q 在一定条件下在一定条件下( (基质限制基质限制) )： f(S)22淮海工学院海洋学院MonodMonod研究了基质浓度与生长速度的关系研究了基质浓度与生长速度的关系MonodMonod方程方程(1949)(1949)00.20.40.60.811.202004006008001000SVVmVm/2Km00.20.40.60.811.202004006008001000SVVmVm/2KmmaxsSKSmaxsSvvKS米氏方程:23淮

13、海工学院海洋学院00 . 20 . 40 . 60 . 811 . 202 0 04 0 06 0 08 0 01 0 0 0SVVmVm/2KmmaxsSKS ：菌体的生长比速菌体的生长比速 S：限制性基质浓度限制性基质浓度 Ks：半饱和常数半饱和常数max: 最大比生长速度最大比生长速度单一限制性基质单一限制性基质：就是指：就是指在培养微生物的营养物中，在培养微生物的营养物中，对微生物的生长起到限制对微生物的生长起到限制作用的营养物。作用的营养物。24淮海工学院海洋学院Monod方程的参数求解(双倒数法)：将Monod方程取倒数可得：111smmSKsmmSKS或： 这样通过测定不同限制性

14、基质浓度下，微生物的比这样通过测定不同限制性基质浓度下，微生物的比生长速度，就可以通过回归分析计算出生长速度，就可以通过回归分析计算出Monod方程的两方程的两个参数。个参数。maxsKSS25淮海工学院海洋学院例：在一定条件下培养大肠杆菌，得如下数据：S(mg/l) 6 33 64 153 221(h-1) 0.06 0.24 0.43 0.66 0.70求在该求在该培养条件下，求大肠杆菌的培养条件下，求大肠杆菌的maxmax，KsKs和和t td d? ?解解：将数据整理：将数据整理：S/ 100 137.5 192.5 231.8 311.3 S 6 33 64 153 221smmSK

15、S26淮海工学院海洋学院max，1.11 (h-1); Ks97.6 mg/L01002000100200300400 /ssm10.9m108.4sktdln2/ max0.64 hsmmSKS27淮海工学院海洋学院2.4.1 初级代谢产物和次级代谢产物初级代谢产物和次级代谢产物次级代谢产物：次级代谢产物：还有一类产物，对细胞的代谢功能没有明显还有一类产物，对细胞的代谢功能没有明显 的影响，一般是在稳定期形成，如抗生素等，的影响，一般是在稳定期形成，如抗生素等， 这一类化合物称为次级代谢产物。这一类化合物称为次级代谢产物。初级代谢产物：初级代谢产物：微生物合成的主要供给细胞生长的一类物质。微

16、生物合成的主要供给细胞生长的一类物质。 如氨基酸、核苷酸等等，这些物质称为初级如氨基酸、核苷酸等等，这些物质称为初级 代谢产物。代谢产物。2.4 产物形成动力学的基本概念产物形成动力学的基本概念28淮海工学院海洋学院2.4.2 GadenGaden对发酵的三分类与对发酵的三分类与PirtPirt方程：方程：一类发酵一类发酵 产物的形成和菌体的生长相偶联产物的形成和菌体的生长相偶联xp29淮海工学院海洋学院二类发酵二类发酵 产物的形成和菌体的生长部分偶联产物的形成和菌体的生长部分偶联xp30淮海工学院海洋学院三类发酵三类发酵 产物的形成和菌体的生长非偶联产物的形成和菌体的生长非偶联xp31淮海工

17、学院海洋学院PirtPirt方程方程 a + bq a=0、b0： 可表示一类发酵可表示一类发酵q a0、b 0： 可表示二类发酵可表示二类发酵q a0、 b= 0：可表示三类发酵可表示三类发酵32淮海工学院海洋学院SS1 菌体菌体S2 产物产物S3 维持维持 XS（底物）底物） X（菌体）菌体） P（产物）产物）+维持维持维持消耗维持消耗(m) ：指指维持细胞最低活性所维持细胞最低活性所需消耗的能量，一般需消耗的能量，一般来讲，单位重量的细来讲，单位重量的细胞在单位时间内用于胞在单位时间内用于维持消耗所需的基质维持消耗所需的基质的量是一个常数的量是一个常数。2.5 基质消耗动力学的基本概念基

18、质消耗动力学的基本概念33淮海工学院海洋学院 XS（底物）底物） X（菌体）菌体） P（产物）产物）+维持维持m: 维持消耗系数维持消耗系数YP/s: 产物对基质的理论得率系数产物对基质的理论得率系数XPssmYYYX/s: 细胞对基质的理论得率系数细胞对基质的理论得率系数312dsdsdsdsdtdtdtdt物料衡算：34淮海工学院海洋学院2.6 反应动力学的应用反应动力学的应用连续培养的操作特性连续培养的操作特性连续反应器：连续反应器：流入速度流入速度=流出速度流出速度=F35淮海工学院海洋学院V: 反应器内发酵液体积反应器内发酵液体积(L)X: 反应器内菌体浓度反应器内菌体浓度(g/L)

19、So: 流加发酵液中基质的浓度流加发酵液中基质的浓度(g/L)S: 反应器内基质的浓度反应器内基质的浓度(g/L)F: 补料速度补料速度(L/h)36淮海工学院海洋学院物料衡算（连续培养的反应器特性）物料衡算（连续培养的反应器特性）对对菌体菌体: :稳态稳态0d xd td xVx VF xd txVFxFDV稀释率稀释率(D):(D):补料速度与补料速度与反应器体积反应器体积的比值的比值(h(h-1-1) )37淮海工学院海洋学院o物料衡算（连续培养的反应器特性）物料衡算（连续培养的反应器特性）对基质对基质: :稳态稳态0d sd t0dsVFsxVFsdt稀释率(D):补料速度与反应器体积

20、的比值(h-1)0()Dssx38淮海工学院海洋学院D0()sD sxXsYmaxsKSSDSx连续培养操作的模型分析连续培养操作的模型分析0maxmax0sSKS最大Dmax时会造成菌体的洗出39淮海工学院海洋学院02468101200.20.40.60.811.2DS, X, DXXSDX连续培养的操作特性连续培养的操作特性40淮海工学院海洋学院连续培养富集微生物的原理连续培养富集微生物的原理连续培养中，最终在此培连续培养中，最终在此培养体系中生存下来的微生养体系中生存下来的微生物都是此时刻对该种底物物都是此时刻对该种底物表现出最大生长的微生物表现出最大生长的微生物（或一个微生物生态）。（

21、或一个微生物生态）。s0当当只有只有B时时建立稳态：建立稳态：B=D,对应对应S0如果引入微生物如果引入微生物A：= A (S0)A Dx增加增加s下降下降A B下降下降BD被洗出被洗出41淮海工学院海洋学院3 发酵过程的代谢控制发酵过程的代谢控制 发酵过程控制是发酵的重要部分发酵过程控制是发酵的重要部分 控制难点：过程的不确定性和参数的非线性控制难点：过程的不确定性和参数的非线性 同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次会得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素次会得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素是复杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基是复

22、杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一般方法对于控制代谢是十分握分析发酵过程的一般方法对于控制代谢是十分必要的必要的42淮海工学院海洋学院3.1 3.1 发酵过程工艺控制的目的、研究的方法发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次和层次3.2 3.2 发酵过程的中间分析发酵过程的中间分析43淮海工学院海洋学院3.1.1 发酵过程的种类发酵过程的种类分批培养分批培养补料分批培养补料分批培养半连续培养半连续培养连续培

23、养连续培养3.1 发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次44淮海工学院海洋学院1 1、 分批发酵分批发酵简单的过程，培养基中接入菌种以后，简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。随时间变化。45淮海工学院海洋学院分批培养中微生物的生长分批培养中微生物的生长迟滞期迟滞期对数生长期对数生长期稳稳 定定 期期死亡期死亡期46淮海工学院海洋学院分批培养的优缺点分批培

24、养的优缺点优点优点 操作简单，周期短，染菌机会少，生产操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握过程和产品质量容易掌握缺点缺点 产率低，不适于测定动力学数据产率低，不适于测定动力学数据47淮海工学院海洋学院2 2、补料分批培养、补料分批培养 在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液的取在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用始时有所增加。在

25、工厂的实际生产中采用这种方法很多。这种方法很多。48淮海工学院海洋学院补料分批培养的优缺点补料分批培养的优缺点优点优点 在这样一种系统中可以维持低的基质浓在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。工艺。缺点缺点 由于没有物料取出，产物的积累最终导致由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染比生产速率的下降。由于有

26、物料的加入增加了染菌机会菌机会49淮海工学院海洋学院3 3、半连续培养、半连续培养在补料分批培养的基础上间歇放掉部分在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。某些发酵液（带放）称为半连续培养。某些品种采取这种方式，如四环素发酵品种采取这种方式，如四环素发酵优点优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量提高了总产量。缺点缺点 代谢产生的前体物被稀释，提取的总代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大体积增大50淮海工学院海洋学院4 4、连续培养、连续培养发酵过程中一

27、边补入新鲜料液一边放出等量发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。度，限制性基质浓度都是恒定的。51淮海工学院海洋学院连续培养的优缺点连续培养的优缺点优点优点 控制稀释速率可以使发酵过程最优化。控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由于发酵周期长，得到高的产量。由于D，通过，通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学力学缺点缺点 菌种不稳定的话，长期连续

28、培养会引起菌菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。加。52淮海工学院海洋学院3.1.2 发酵过程工艺控制的目的发酵过程工艺控制的目的有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来目标是得到最大的比生产速率和最大的生产目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率率53淮海工学院海洋学院发挥菌种的最大生产潜力考虑之点发挥菌种的最大生产潜力考虑之点菌种本身的代谢特点菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸强度、生长速率、呼吸强度、营

29、养要求（酶系统）、代谢速率营养要求（酶系统）、代谢速率菌代谢与环境的相关性菌代谢与环境的相关性 温度、温度、pH、渗透压、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等离子强度、溶氧浓度、剪切力等54淮海工学院海洋学院微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈网络形式，比微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈网络形式，比如糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的前体，可能用如糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的前体，可能用作合成产物的前体，也可能合成副产物，而这些前体有可作合成产物的前体，也可能合成副产物，而这些前体有可能流向不同的反应方向，环境条件的差异会引发代谢朝不能流向不同的反应方向，环境条件的差异会引发

30、代谢朝不同的方向进行。同的方向进行。因此对发酵过程的了解不能机械的，割裂的去认识，而要因此对发酵过程的了解不能机械的，割裂的去认识，而要从细胞代谢水平和反应工程水平全面的认识。从细胞代谢水平和反应工程水平全面的认识。微生物的生长与产物合成有密切相关性，不仅表现在菌体微生物的生长与产物合成有密切相关性，不仅表现在菌体量的大小影响产物量的多少，而且菌体生长正常与否，即量的大小影响产物量的多少，而且菌体生长正常与否，即前期的代谢直接影响中后期代谢的正常与否。特别是对于前期的代谢直接影响中后期代谢的正常与否。特别是对于次级代谢产物的合成更具有复杂性。次级代谢产物的合成更具有复杂性。55淮海工学院海洋学

31、院发酵过程受到多因素又相互交叉的影响如菌本身的遗发酵过程受到多因素又相互交叉的影响如菌本身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因素、环境因素传特性、物质运输、能量平衡、工程因素、环境因素等等。因此发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。等等。因此发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。 为了全面的认识发酵过程，本章首先要告诉大家为了全面的认识发酵过程，本章首先要告诉大家分析发酵过程的基本方面，在此基础上再举一些例子，分析发酵过程的基本方面，在此基础上再举一些例子，说明如何综合分析发酵过程及进行优化放大。说明如何综合分析发酵过程及进行优化放大。56淮海工学院海洋学院3.1.3 发酵过程研究的方法和层次发

32、酵过程研究的方法和层次1、研究方法、研究方法单因子实验单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验验优点优点 一次可以进行多种条件的实验，可以在较一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到的结果。快时间内得到的结果。缺点缺点 如果考察的条件多，实验时间会比较长如果考察的条件多，实验时间会比较长各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性确性57淮海工学院海洋学院数理统计学方法数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析运用统计学方法

33、设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。设计、响应面设计。优点优点 同时进行多因子试验。用少量的实验，经过同时进行多因子试验。用少量的实验，经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。大大提高了实验效率。 但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。较大的误差就会得出错误的结果。5

34、8淮海工学院海洋学院2 2、研究的层次、研究的层次初级层次的研究初级层次的研究：一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适最适pH等要求。等要求。摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试验几十种摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优化有较高甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优化有较高的效率。的效率。59淮海工学院海洋学院代谢及工程参数层次研究代谢及工程参数层次研究：一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的一般在小型反应

35、器规模进行试验。在摇瓶试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的，所以方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的，所以得到的代谢情况比较可信。得到的代谢情况比较可信。60淮海工学院海洋学院生产规模放大生产规模放大：在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐在大型发酵罐规模进

36、行试验。将小型发酵罐的优化条件在大型反应器上得以实现的优化条件在大型反应器上得以实现,达到产达到产业化的实现。业化的实现。一般来说微生物在不同体积的反应器中的生一般来说微生物在不同体积的反应器中的生长速率是不同的，原因可能是，罐的深度造长速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，成氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，剪切力不同，灭菌时营养成分破坏程度不同剪切力不同，灭菌时营养成分破坏程度不同所致。所致。61淮海工学院海洋学院3.2 发酵发酵过程的中间分析过程的中间分析发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微

37、生物的主要代谢变化。因为示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。以说中间分析是生产控制的眼睛。这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如发酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等62淮海工学院海洋学院代谢参数按性质分可分三类：代谢参数按性质分可分三类：物理参数：物

38、理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等浓度等化学参数：化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等产物浓度、核酸量等生物参数：生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等63淮海工学院海洋学院从检测手段分可分为：直接参数、间接从检测手段分可分为：直接参数、间接参数参数直接参数：直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得通过仪器或

39、其它分析手段可以测得的参数，如温度、的参数，如温度、pH、残糖等、残糖等间接参数：间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、如摄氧率、KLa等等64淮海工学院海洋学院直接参数又可分为直接参数又可分为: 在线检测参数和离在线检测参数和离线检测参数线检测参数在线检测参数在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上安装指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；、搅拌转速；离线检测参数离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如指取出样后测定得到的参数，如残糖、残糖、NH2-N、菌体浓度。、菌体浓度。65淮海工学院海洋

40、学院3.2.1 3.2.1 发酵过程主要分析的项目发酵过程主要分析的项目目前发酵过程主要分析项目如下目前发酵过程主要分析项目如下1 1、pHpH pH与微生物的生命活动密切相关与微生物的生命活动密切相关 酶酶催化活性催化活性 pH的变化又是微生物代谢状况的综合反的变化又是微生物代谢状况的综合反映映基质代谢、产物合成、细胞状态、基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况营养状况、供氧状况66淮海工学院海洋学院2 2、排气氧、排气、排气氧、排气COCO2 2和呼吸熵和呼吸熵排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还剩余的氧，因此排气氧的大小反映了

41、菌生长的活性，剩余的氧，因此排气氧的大小反映了菌生长的活性，通过计算可以求得摄氧率（通过计算可以求得摄氧率（OUR）。）。排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微生排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，有的进入物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，有的进入代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此消耗的氧代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的氧。氧。67淮海工学院海洋学院RQ值随

42、微生物菌种的不同，培养基成分的不同，值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，生长阶段的不同而不同。测定生长阶段的不同而不同。测定RQ值一方面可以了值一方面可以了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料CER表示单位体积发酵液单位时间内释放的二表示单位体积发酵液单位时间内释放的二氧化碳的量氧化碳的量呼吸熵呼吸熵OURCERRQ 呼吸熵反映了氧的利用状况呼吸熵反映了氧的利用状况68淮海工学院海洋学院 一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维使菌体处于半饥饿状态，在

43、营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。对于这种持产生次级代谢产物的速率在较高水平。对于这种工艺，后期的补料控制是关键。过程中发现，在补工艺，后期的补料控制是关键。过程中发现，在补糖开始时，不但糖开始时，不但CER、OUR大幅度提高，连大幅度提高，连RQ也也提高约提高约10，表明通过补糖不但提供了更多的碳源，表明通过补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。力也提高，产能增加。69淮海工学院海洋学院3 3、糖含量、糖含量微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。微生物生长和产物合成与糖代谢

44、有密切关系。糖的消耗糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况反映产生菌的生长繁殖情况 反映产物合成的活力反映产物合成的活力菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。糖含量测定包括总糖和还原糖。糖含量测定包括总糖和还原糖。 总糖总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖淀粉、饴糖、单糖等各种糖

45、。 还原糖还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。70淮海工学院海洋学院4 4、氨基氮和氨氮、氨基氮和氨氮氨基氮氨基氮指有机氮中的氮（指有机氮中的氮（NH2-N），单位是），单位是 mg/100ml。如。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。氨氮氨氮指无机氨中的氮（指无机氨中的氮（NH3-N）。）。氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受

46、到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。71淮海工学院海洋学院5 5、磷含量、磷含量微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。磷是核酸的组成部分，是高能化合物磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在

47、培组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。要采取补磷措施。72淮海工学院海洋学院6 6、菌浓度和菌形态、菌浓度和菌形态菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。菌形态菌形态 显微镜观察显微镜观察菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。补料量适

48、合与否的一个参数。73淮海工学院海洋学院74淮海工学院海洋学院75淮海工学院海洋学院7 7、产物浓度、产物浓度 在培养过程中，产生菌的合成能力和产物积在培养过程中，产生菌的合成能力和产物积累情况都要通过产物量的测定来了解，产物浓累情况都要通过产物量的测定来了解，产物浓度直接反映了生产的状况度直接反映了生产的状况,是发酵控制的重要是发酵控制的重要参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比生产速率，从而分析发酵条件如补料、生产速率，从而分析发酵条件如补料、pH对对产物形成的影响。产物形成的影响。76淮海工学院海洋学院3.2.2 产物量的测定产物量的测定3.2.

49、2.1 产物量的特殊表示法产物量的特殊表示法抗生素效价的表示抗生素效价的表示抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（效价大小用单位（U）来表示）来表示效价表示方法：重量折算法效价表示方法：重量折算法 重量单位重量单位 类似重量单位类似重量单位 特殊单位特殊单位77淮海工学院海洋学院重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个单位，如青霉素单位，如青霉素0.6微克微克1U重量单位：规定某些抗生素活性部分重量单位：规定某些抗生素活性部分1g=1u 如链霉素、卡那霉素、红霉素等如链霉素、卡那霉素、红霉素等定义活性部分定义活性

50、部分1g1u78淮海工学院海洋学院类似重量单位：规定抗生素的某种盐类似重量单位：规定抗生素的某种盐1mg=1000u如金霉素、四环素的盐酸盐定一如金霉素、四环素的盐酸盐定一为为1g1u特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位制霉菌素制霉菌素 1mg=3700u多粘菌素多粘菌素B 1mg=10000u79淮海工学院海洋学院酶活力的表示法酶活力的表示法酶活力用单位来表示。由于酶通常不是很纯，酶活力用单位来表示。由于酶通常不是很纯，不能用重量来表示酶的量。同一种酶用不同不能用重量来表示酶的量。同一种酶用不同的方法测定会有不同的酶活单位，容易造成的方法测定会有不同的酶活

51、单位，容易造成混乱，为此国际上作了统一规定，规定在混乱，为此国际上作了统一规定，规定在250C下，下，以最适的底物浓度，最适的缓冲液以最适的底物浓度，最适的缓冲液离子强度，以及最适的离子强度，以及最适的pH诸条件下，每分钟诸条件下，每分钟能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性单位。单位。80淮海工学院海洋学院3.2.2.2 产物量的测定产物量的测定1 1、化学法、化学法（1）滴定法）滴定法产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可用滴定产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可用滴定法法如青霉素在碱性条件下加入过量的如青霉素在碱性条件下加入过量的I2，反应生成

52、青霉噻，反应生成青霉噻唑酸碘，用唑酸碘，用Na2S2O3滴定多余的碘，可计算出青霉素的滴定多余的碘，可计算出青霉素的单位单位计算青霉素效价青霉噻唑酸碘青霉素滴定多余过量23222,IOSNAIOH柠檬酸可以用柠檬酸可以用NaOH滴定来计算柠檬酸产量滴定来计算柠檬酸产量81淮海工学院海洋学院（2）比色法）比色法产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物浓产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物浓度成正比，可以用比色法测定。度成正比，可以用比色法测定。蓝色麦芽酚链霉素加热，22,FeOHOH淀粉酶活力测定：在淀粉酶活力测定：在1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所释放出的

53、麦芽糖与生色试剂（酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（3，5-二硝基水二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生颜色，它在杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生颜色，它在540nm处所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。处所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。82淮海工学院海洋学院（3）测压法）测压法 产物特定反应放出或摄入气体，使系统有压力产物特定反应放出或摄入气体，使系统有压力变化，可以通过测定压力变化得知产物量。变化，可以通过测定压力变化得知产物量。2、物理法、物理法 许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或光性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或

54、抗生素的含量。抗生素的含量。谷氨酸谷氨酸谷谷氨氨酸酸脱脱氢氢酶酶氨基丁酸氨基丁酸CO283淮海工学院海洋学院化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于过程化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于过程分析分析缺点产品中存在的杂质会干扰测定结果，因此抗生缺点产品中存在的杂质会干扰测定结果，因此抗生素成品的测定用生物法测定。素成品的测定用生物法测定。 适用于抗生素效价的测定适用于抗生素效价的测定 生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准，其其原理恰好与临床应用的要求相一致，而且此法灵敏原理恰好与临床应用的要求相一致，而且此法灵敏度高，需用的检品量较小，这是其它方

55、法不能比的。度高，需用的检品量较小，这是其它方法不能比的。但此法得到结果比较慢，需经过但此法得到结果比较慢，需经过1618小时培养。小时培养。生物法常用于发酵终了产品效价的测定。生物法常用于发酵终了产品效价的测定。3 3、生物法、生物法84淮海工学院海洋学院主要的控制参数主要的控制参数 1、pH值（酸碱度） 2、温度 3、溶解氧浓度 4、基质含量 5、空气流量 6、压力 7、搅拌转速 8、搅拌功率 9、黏度 10、浊度 11、料液流量 12、产物的浓度 13、氧化还原电位 14、废气中的氧含量 15、废气中的CO 2含量 16、菌丝形态 17、菌体浓度 18、泡沫4 微生物发酵过程工艺参数控制

56、微生物发酵过程工艺参数控制85淮海工学院海洋学院 4.1 发酵过程的发酵过程的pH控制控制 4.2 温度变化及其控制温度变化及其控制 4.3 溶氧的影响及控制溶氧的影响及控制 4.4 发酵过程泡沫的形成与控制发酵过程泡沫的形成与控制86淮海工学院海洋学院4.1 发酵过程的发酵过程的pH控制控制 pH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。行，所以是十分重要的参数。发酵过程中发酵过程中pH是不断变化的，通过观察是不断变化的，通过观察pH变变化规律可以了解发酵的正常与否化规律可以了解发酵的正常与否87淮海工学院海洋学院4.1.1 发酵过

57、程发酵过程pH变化的原因变化的原因 1 1、基质代谢、基质代谢 （1）糖代谢）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，下降。糖缺乏，pH上升，是补料上升，是补料的标志之一的标志之一（2）氮代谢）氮代谢 当氨基酸中的当氨基酸中的-NH2被利用后被利用后pH会下会下降；尿素被分解成降；尿素被分解成NH3，pH上升，上升，NH3利用后利用后pH下下降，当碳源不足时氮源当碳源利用降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。上升。（3）生理酸碱性物质利用后）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降会上升或下降88淮海工学院海洋学院2 2、产物

58、形成产物形成 某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变变化。如有机酸类产生使化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。上升。 3 3、菌体自溶菌体自溶，pH上升，发酵后期，上升，发酵后期，pH上升。上升。 89淮海工学院海洋学院4.1.2 pH对发酵的影响对发酵的影响 例例 pH对林可霉素发酵的影响对林可霉素发酵的影响 林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，下降，待有机酸被

59、生产菌利用，pH上升。若不及上升。若不及时补糖、时补糖、(NH4)2SO4或酸，发酵液或酸，发酵液pH可迅速升到可迅速升到8.0以上，以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。对照罐发酵对照罐发酵66小时小时pH达达7.93，以后维持在，以后维持在8.0以上至以上至115小小时，菌丝浓度降低，时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。升高，发酵不再继续。发酵发酵15小时左右，小时左右，pH值可以从消后的值可以从消后的6.5左右下降到左右下降到5.3，调节这一段的调节这一段的pH值至值至7.0左右，以后自控左右，以后自控pH，

60、可提高发酵可提高发酵单位。单位。1、实例、实例90淮海工学院海洋学院（1）pH影响酶的活性。当影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻的活性时使菌的新陈代谢受阻（2） pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行 （3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用从而影响微生物对这些物质的利