哺乳动物细胞表达系统

1、哺乳动物细胞表达系统动物基因工程原理特点与优势哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白 质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的0型 糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分 子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然 的高等生物蛋白质分子。应用领域哺乳动物细胞表达系统已成为多种基因工程药物的生产平台。哺乳动物细胞表达系统在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。研究现状部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生 产或中试生产阶段。-已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达 和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、 凝血因子VIII、干

2、扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、 人生长激素、人抗凝血素川，集落刺激因子等。哺乳动物细胞表达系统的表达水平从整个水平上看仍偏低， 一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即 30 |ig/IO8细胞/24小时。其限速步骤可能是在工程细胞中重 组蛋白的分泌效率较低。、稳定表达细胞系的筛选构建目的基因的表达载体。确定受体细胞。确定筛选方法(抗生素的使用浓度)。转染后48h,传代铺板(1 : 100)，加筛选药物。 3-4d换液1次，直至存活细胞长出岛状细胞簇，约2周。克隆耐药细胞，检测目基因的存在与表达。二、哺乳动物细胞表达系统（一）宿主细胞（二）表达载体的构建（三）表达细胞株的基因共土广

3、增和筛选方法（四河调控的哺乳动物细胞表达系统高等哺乳动物受体细展高等哺乳动物细胞的生长特性高等哺乳动物受体细胞的条件高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 常用的高等哺乳动物受体细胞高等哺乳动物细胞的生长特性正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存 活50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有 时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并 无限

4、制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞 系O高等哺乳动物受体细胞的条件以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具 备以下条件：细胞系特征：丧失细胞接触抑制和锚地依赖特征，便于大 规模培养。遗传稳定性：外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期 保存。合适的标记：便于转化株的筛选和维持。生长快且齐：分裂周期短，生长均一，便于控制。安全性能好：不合成分泌致病物质，不致癌。高等哺乳动物受体细胞的遗传标记遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH-氨基糖昔磷酸转移酶G418APH 灭活 G418DHFR二氢叶酸还原酶氨甲喋哙DHFR变体抗氨甲碟吟HPH潮霉素B磷酸转移酶潮霉素BHPH灭活潮

5、霉素BTK-胸腺卩密唳核昔激酶氨甲喋哙TK合成TMPXGPRT-黄瞟哙鸟瞟哙磷酸核糖霉酚酸XGPRT和成转移酶GMPADA-腺瞟吟核昔脱氨酶腺瞟吟木酮糖昔ADA-灭活 Xyl-A宿主细胞常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠 肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨 髓瘤SP2/0细胞等。不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型 不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。常用的高等哺乳动物受体细朋迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规 模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细 胞（CHO）,其优势有如下几个方面：遗传背景清

6、楚，生理代谢稳定与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确基因转移和载体表达系统完善耐受剪切力，便于大规模培养被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞宿主细胞猴肾细胞(cos)是进行外源基因瞬时表达时用途最广的 宿主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入DNA 的量或者采用基因组DNA序列的情况都没有什么限制，便 于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性克隆，也利于快 速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。宿主细胞近几年也陆续发现了几种新的有较大应用价值的细胞株：如来源于Madlin-Darb y犬肾的高分化内皮细胞株(MDCK)。 Pei等用该细胞株表达分泌型的基质金属蛋白酶MMPI3,发现 高

7、表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的5%10%,其中一个 克隆的表达量可占细胞上清总蛋白的15%20%,在细胞单层 贴壁培养情况下表达量达10 mg/Lo对细胞株选择性地进行遗传改造 BHK/V16细胞株是稳定表达单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白的BHK细胞，由于VP16的转录激活作用，载体中的HSV早期启动子在该工程细胞中有很高的活性o已用该细胞株获得了包括人组织纤溶酶原激活剂、生长因 子等在内的多种蛋白的高效稳定表达。对细胞株选择性地进行遗传改造基于腺病毒EIA蛋白可反式激活CMV启动子，Cockett等建 立了稳定表达EIA的CHO细胞株，在该细胞中重组前胶原 酶的产量与CHO细胞相比增加

8、了 12倍；该细胞在多种抗体 的表达中亦取得满意的结果。对细胞株选择性地进行遗传改造对细胞其它特性的遗传改造，包括细胞生长周期 的调控、细胞的抗凋亡能力、细胞贴壁能力、蛋 白糖基化的模式等方面，亦有相关报道，其实际 应用价值有待得到更多实验数据的支持。真核表达载体哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括：一个高活性的启 动子、转录终止序列和一个有效的mRNA翻译信号。原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便 于筛选含重组细菌的抗生素抗性基因，以及便于目的基因 插入的限制性酶切位点。可视实验需要加入标志基因、内含子、内部核糖体进入位 点等。4g>N§k bXhol Xba

9、rHind III Kpn I BamH I QstXI EcoR I EcoR V BstXINot I真核表达载体常用的标记基因有胸腺激酶(tk)基因、二氢叶酸还原酶 (dhfr)基因新霉素(neo)抗性基因、氯霉素乙酰基转移酶 (cat)基因等 dhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当 培养基中逐渐增加氨甲蝶吟(MTX)的浓度时，随着细胞对 MTX抗性的增加。dhfr基因与外源基因均明显扩增。据文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。真核表达载体启动子外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要 是启动子和增

10、强子的强弱以及它们之间的搭配。启动子需包含两个识别序列：mRNA转录起始点和TATA 盒。TATA盒位于转录起始位点上游25-30bp处，是引导 RNA聚合酶在正确起始位点转录所必需的序列，即保证转 录的精确起始。其他上游启动子元件常位于TATA盒上游 100200bp之间，其功能是调节转录的起始频率和提高转 录效率。启动子和增强子受细胞类型的限制，在不同的细 胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞的类型 选择不同的启动子和增强子以便于目的基因的高 效委达。目前常用的强启动子包括人巨细胞病毒早期启动 子(CMV-IE)V人延伸因子1 亚基启动子和Rous肉 瘤长末端重复序列；Invitrogen

11、公司开发的pcDNA、 pEF和pRL三种系列载体即分别是以这三种启动子 驱动目的基因的表达。近年来又发现了一些新的强启动子，如：人leukosiali n基因启动子和鼠3-磷酸甘油激酶1 (PGKI)基因启动子，活性与CMV-IE相当。人泛素蛋白(ubiquitin)C基因启动子不仅具有较高的活性，而且比CMV-IEx PGK1等启动子有更广泛的宿主细胞范围，几乎在转基因小鼠的所有组织细胞中都具有较高活性。构建杂合的启动子是获得新启动子的一个重要途径。 比如由人ubiquitin C启动区序列与CMV增强子组成 的杂合启动字、由SV40早期启动子和人I型T淋巴 细胞病毒LTR中的增强子序列（

12、R-U5片段）组成的 SR-a启动子的活性均与CMV-IE相当；由鸡卩-肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的 杂合启动子不仅活性比CMVIE高，而且具有更 为广谱的宿主细胞范围。Novagen公司的pBacMam 表达系统即是以该杂合启动子驱动目的基因的转录。另一类杂合启动子是由活性很低的启动子与数个转录激活 因子结合位点串联而成，这些位点与转录激活因子的结合 受细胞外小分子药物的调控；这类启动子主要用作基因的 诱导表达。如Invitrogen公司的ecdysone (脱皮激素)诱导表达系统， 其负责目的基因转录的启动子是由敝休克蛋白启动子核心 序列(minimal promotor)和5个

13、E/GRE元件组成； Clontech公司开发的Tet-off系统中的启动子则由CMV启动 子的核心序列和7个Tet阻遏蛋白结合位点组成。这些启动子在诱导前后活性可相差4个数量级。在哺乳动物细胞中已发现存在大量在低氧环境中可诱导转录 的基因，如编码红细胞生成素(EPO)、转铁蛋白、血红素加 氧酶-1等的基因，它们都有一个共同的顺式作用元件 (CGTG ),有利于在亍或3,侧翼区的低氧诱导作用因子-1 (HIF-1)和低氧反应增强子(HRE)结合，激活靶基因的转录， 在低氧浓度下可使重组蛋白大量表达。据报道红细胞生成素启动子在1%氧浓度比在21%氧浓度下活 性增强100倍。这又是一种新的提高表达

14、量的作用机制。真核表达载体增强子常用的增强子有Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列和人巨细胞病毒增强子。 James等利用糖皮质类固醇诱导的鼠乳房瘤病毒(MMTV)启 动子和鼠乳房瘤病毒长末端重复序列(MMTV-LTR),在CHO细胞中表达分泌的碱性磷酸酶，产量为利用常规的SV40和CMV启动子的10倍，超过04mg/ml。内含子某些内含子有重要的基因功能调控序列，目的基因以基因 组形式克隆入载体能得到高表达。为增加转录产物的稳定性，表达载体中一般含有天然的或 人工合成的内含子序列。 mRNA前体的剪切能够促进mRNA从胞核向胞质的运输。外显子和内含子接头每个外显子和内含子接头区都有一 段高度保

15、守的一致序列(consensus sequence),即内含子 5,末端大多数是GT开始，3,末端大多数是AG结束，称为 GT-AG法则，是普遍存在于真核基因中RNA的识别信号。转录终止序列真核基因的hnRNA的加工过程需要Poly A信号，在目的基因 3端加上PolyA,表达水平提高10倍以上。 SV40的早期和晚期PolyA.牛生长激素基因PolyA.人工合成PolyA.or阳IIH 吊eH INh e I 増迪I EcoR IMU/1 XiwlAccl Sfna I BstZi Waf I7 SV*1O Entianc&r7V| Carl/ Prcrfnoter pgl VECt

16、Df(363?cpjlnlron<. 肉阴 |SV40 LaiePoly(A) j6786B468969&707713714720724724mIntronCM.V L E,、EinharHner/iPrcfriDlerVector(tDOGhp)SV40 Laiesxily(A)Bgl.llfisrt»8 I10521O5S10631D69W?91D81W710881410081098Bc?rnH IT7丄|Xtol £TcoR IK肿I Xba H San Accl Sma I ferzi to iBgl.llBgl.llAmprSyntheticpoly

17、(A)BamHIon 1CMVEiihancer/PromoterpCl-neaVecto(5472bp)InlronSgllhPpolSV4O Laiepoly(A)SV40 Enhancer/Early ProiwlenT7 1NhelXholEcoRlMlul Xbal Sall Ac Cl SinaiNoilT3 TfisQ 196031 4202 1273 1Bgl.llIRES IRES (internal Ribosome entry site)内部核糖体切入 位点，可从一个mRNA翻译二个ORF。IRES位于小RNA病毒RNA5,非编码区，约为450bp。 IRES可与它连接的

18、ORF同时翻译，构建双顺反子和 多顺反子真核表达载体。Bgl II,：13：, /Vn/I(209)(2939)9C0CGAGCTCGGATCGATATCTGCGGCCGCGTCGACGGgVTTCAGTGGATCCACh I* £mR V Not IEcoR I BamH I950CTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTAATTCGBstXI:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase I:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase

19、IMCS AT7 Promoter iora10910ffl1100hid:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase I:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase ITAATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGMTTCACGCGTCGAGCANhe Xhol EcoRIMCSBT2 Promoter17201730174017E017TOXbal Sail Xma I / Not ISma I * Eag I:TOPO:TOPOIF Rci?i

20、 citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase I:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase IT7V5 epitope6xHis:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase I申il jjjflp%pcDNA3.1/V5-二His-TOPO*5.5 kb 封:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase IWCoriSee pulyliiikur sequen

21、ce nn ihe web.:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase I分泌表达载体ATG Iqk Leader> HOCJI-II 一tnCL 一CCGOL1I -X巒 -工 ErsOQ-签< -多 一 ZX 一ON -XSEg epitope (Hisk TAA哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因哺乳动物细胞内的基因扩增现象基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊方式。氨甲喋吟（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶CDHFR）的特异性抑制剂，细胞培养

22、物经氨甲喋吟处理后，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，助fr基因均得以扩 增。这些抗性细胞正是通过増加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶 的表达水平，从而抵消氨甲喋吟的抑制效应。更重要的是，扩增的区 域远远大于dM基因本身，即与亦片基因相邻的DNA区域同时被扩增。哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因外源基因dhfrDHFR-MTX高效表达系统哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因GS-MSX高效表达系统谷氨酰胺合成酶(GS)能解除甲硫氨酸亚枫(MSX)对动物细胞的毒害作用。先将带有GS编码基因的载体转入培养的哺乳动

23、物细胞中，由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX,所以在转染过程中不必使用GS缺陷型的受体细胞,而且在正常的MSX浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR-MTX系统优越之处。利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂第一个由重组哺乳动物 细胞规模化生产的医用蛋白 是治疗急性心肌梗塞的溶血 栓药物：人组织型纤溶酚原 激活剂（tPA） °同样采用 DHFR-MTX系统表达，受体 细胞选用CHO系统。目前，人 tPA cDNA终止子dhfr用该工艺路线生产的重组人tPA已经商品化。此外，人tPA也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低。可调控

24、的哺乳动物细胞表达系统四环素（tet）调控表达系统U!TJ勺相关,加入或撤除四环素和四环素衍生物来调控基因表达。 外源基因表达的水平与所加的Tc浓度在一定范围 因而可通过控制tet的浓度来控制基因表达的水平。 应用于研究基因不同水平的表达对细胸，个体发育的影响 有何不同。tetRAytRExpRB&sion RepressedTATAgene of intarast+ tetl)TMAgem of-爭一 8-03M-2-weA鹫応二£一 Hgrc-A*一二三匸w 一是弋 -i| pcDNAw5/T07 trh5ev iiotylinker set|iiencts mi she

25、 web.pcDNAP/TO/吋 1 也 AXkC 5.1 kb)-=&SxHb一一ulnQI I冬-OS -3< my A?ul z£ ug -=wg 二仝 f決< 一 ？-s£科E ptrwvr n nP Eor;pcDMA/TO ($.1 kb)-?一一-En$<一 w寸 pcDNAM/TO% Veck)rsI片Ihe major component ot' I he I REx Sy stem is the inducible expression plasmid. Expression oTyour gene of iniercs

26、l Irom llie inducible expression vector h controlled by the strong CMV promoter (Andersson el a!., 1989; Bosh art et al. 1985; Nelson et aL. 1987) into which 2 copies of the tel operator 2 (l'etO2) sequence have been inserted i n laiidein. I he TeiO2 sequences consisi ol' 2 copies of llie 19

27、 nucl已ul】ck sequence.5 -TCC CT AT C AGT GAT AG AGA-3r separated by a 2 base pair spacer (Hillen and Berens, 1994; I lillen et uL. 1983). Each 19 nucleotide TetO2 sequence serves as the binding site lor 2 molecules of the I et repressor. For niore in formation about the Tel operalor sequcnees and the

28、 speciHe features of each inducible expression vector, please reier to Ih 已 msinLial lor the vector vou are us ins.Figure 2 - High levels of induced expression achieved with the T-REx 1 SystemFigure 2 - High levels of induced expression achieved with the T-REx 1 SystemA.B.CSSL3d s-5_-aJy'sr 兀巴.r

29、Rsu 一 rs,dAnti庄阴I wesierjiPkj|MainAj 293 cells stably expiessing the wiracyellne repressor (丁 were irjnsiemly n<insfectft1 wiih a fRtxcAprussiiig ihe !ucZfiene (pcDM A"4/T0/fdrZj or a CMV-based expression plasmid (pcDNAF i/llis/fwX) consiiiuiivly expressing aLiciosidasc. Phiiein expression w

30、as induced by adding I jig/ml or leirjQ'dine for 2斗 hours, .iiivr which ciinp p-g.ilactosidasp ai rivitv was assayeil A cullnrr of stably cidiisfecitid single ceB "TR&T 2字3 chnvs weie stained for |i!-gala.ci;ci- d.w aciivify (B) prior io in duel ion .iiilI (Cj 24 hours i)osi-i.wnsUuUHMi

31、 widi 1 y/inl teiucycline.gwfifirtaraBt1. Ligate gene cf interact Into the inducible region vectorCotransfect this inducible expreGsion vector and pcDHAfi/TR1- into mammalian cells3. Add tetracycllrre to de re press the liybrldCMW/TetO2 promoter and induce expression of the desired gene4. Assay for6

32、Xpre6«d protein四环素调控表达系统构成元件四环素阻遏子(Tet repressor protein,TetR)四环素操纵子(Tet opemtor DNA Sequence, TetO)单纯疱疹病毒Vpl6转录活化区(Vpl6 activation domain,AD)四环素调控反式激活子(Tetracyeline-Contrcdled transactivator tTA)TetR与Vpl6组成融合表达蛋白。四环素转录激活子(tetracyline transcriptional activator, tTA) tTA靶位点由四环素操纵子的几个拷贝42bp大小的串联序

33、列和一个来自细胞巨化病毒(cytomegalovinasCMV)的立即早期启动子启动序列组成一个重组启动子，构建成一个四环素应答表达系统(a tetracycline-responsive express system,TRES)。0tTA反之，去DOX，tTA与TRE结合，达.BDTebOffMU!四环素调控 反式激活子 tTATetR AD加DOX tTA+DOX 结合贝IJtTA不与TRE结合，外 源基因不封 达BD Tet-Off SystemAhabinds TRE and activates transcription in the absence of Dox000反式四环素转录

34、激活子反式四环素调控激活子rTetR (a "reverse Tetrepressor)含突变氨基酸位点的DNA结合蛋白的，含X95 ->Asn95 .LeulOl ->SerlOl , Glyl02Asp 102) o结合四环素后的结构可与调空序列 结合。rtTATet-On SystemrtTAbinds TRE and activates transcription in the presence of DoxTranscriptionriC(iEne of intE restTREThe MreverseM Tet repressor (rTetR) was cr

35、eated by four amino acid changes that reverse the protein's response to Dox. Asa result of these changes, therTetR domain of rtTA binds theTRE and activates transcription in the presence of Dox.Figure 9 pTetCHf and pTet-On composite vector map. Unique sites are in bold. Only pTet-On contains the

36、 second Hind III site at Position #871 This site can be used to distinguish pTeT-O彳f from pTet-On. pT et-Of expresses the tT A (tet transact! vator) regulator protein from thestrong immediate early promoter of cytomegalovirus (PCMV)- pTet-On expresses the rtTA (reverse tTA), which contains four amin

37、o-acid mutations (as marked on the map). In addition, there are several silent mutations in pTet-On In all other respects, the vectors are identical.XhoXho IMCS070-5371(2)P、 TRESV4°PhCMVMpTRE2hygSV40 poly A5.3 kb B呷吵poly AXho I<3759|AmpColElori4/04934905005105GATCCTCTAETCAGCTGAc5cGTGCTAG

38、3;cGGCCGCATdGATBaiM IPvuW Mlu Nhe Noil Cla I514 蛍0AAGCHGTCGACGATATCTCTAGA EcoRVAcclEcoRI (117514/0朋5OJ510GGATCCTCTAGTCAG CTGAcEcGTGCTAGcbcGGCCG CATC GATMH IPw/ll Mli/ Nhe Hoi Cla514!i20530AAG CTTGTCGACGATATCTCTAGAfcoRVGene X 'minWTREI ReporterminWFigure 16. The pBI expression cassette. Two genes

39、-either two genes of interest, a gene of interest and a reporter, ortworeporters-can be expressed simultaneously from the Pbi promoter. Reporters are iirefly luciferase, p-galactosidase, or EGFP.香豆霉素调控表达系统SV40 early promoter 6X Lambda OPXmnl5298ADSV40 early en hancer/ promoterSV40 late poly(A) signa

40、lCMV minimal promoterSynthetic poly(A)signalLambda repressor (DNA binding domain)AmprGyrBpReg neo Vector(68O2bp)(O= kRep-GyrB-AD chimeric acdvatorFigure 1 Schematic representation of the coumerin-regulated system.香豆霉素调控表达系统OnAuto-ampliffcation ol activatorOffLow levelsRapid and Efficient Generation of IsogenicExpression Cell Lines using Targeted IntegrationRapid and Efficient Generation of IsogenicExpression