蛋白质结构解析技术一

1、会计学1蛋白质结构解析技术一蛋白质结构解析技术一第四讲 蛋白质结构解析技术（一）1. 氨基酸序列分析氨基酸序列分析2. X-射线衍射技术射线衍射技术3. 核磁共振核磁共振4. 质谱技术质谱技术5. 结构分析的其它方法结构分析的其它方法 现代光谱技术现代光谱技术 三维电镜重构技术三维电镜重构技术 动力学全局研究技术动力学全局研究技术UV-Vis、 IR 、荧光、荧光、蛋白质结构和构象；蛋白质结构和构象；构象变化过程；构象变化过程； 如：蛋白质折叠过程中间态形如：蛋白质折叠过程中间态形成的时间尺度和机制成的时间尺度和机制. 二级结构形成、卷曲过程，二级结构形成、卷曲过程， 变性和复性过程及机制。变

2、性和复性过程及机制。主主要要内内容容是结构与功能研究的基础一级结构测定的意义：一级结构测定的意义：l寡核苷酸探针寡核苷酸探针的设计与制备的设计与制备 cDNA推导氨基酸序列推导氨基酸序列提供依据提供依据 重组重组DNA产生的蛋白指纹分析产生的蛋白指纹分析l蛋白质的完整结构鉴定蛋白质的完整结构鉴定l确定翻译后修饰的位点确定翻译后修饰的位点l决定簇的定位决定簇的定位l二硫键的确定二硫键的确定采用采用部分水解部分水解的方法的方法试图试图测定蛋白质的氨测定蛋白质的氨基酸序列基酸序列Consden等利用等利用色谱技术色谱技术成功测定了成功测定了短杆菌肽短杆菌肽S6的氨基酸序列的氨基酸序列Sanger首次

3、测定了首次测定了的一级结构（由的一级结构（由51个氨基酸残基组成）个氨基酸残基组成）Spackman、Stein、Moore制造了制造了，使氨基酸定量分析进入了一个崭新，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段的阶段Edman 推出第一台推出第一台牛胰岛素（牛胰岛素（51aa）的一级结构）的一级结构l Sanger首次首次(DNFB法法)测定了测定了牛胰岛素牛胰岛素的一级结构的一级结构 Sanger法（测定蛋白法（测定蛋白N末端的方法）末端的方法）自由自由-氨基与氨基与异硫氰异硫氰酸苯酯酸苯酯(PITC)试剂偶联，与试剂偶联，与其紧挨的其紧挨的第二个残基第二个残基的键合的键合力大大减弱，很容易断裂

4、。力大大减弱，很容易断裂。 在无水条件下酸在无水条件下酸（F3CCOOH）裂解，形）裂解，形成成苯氨基噻唑啉酮苯氨基噻唑啉酮衍生衍生物物（ATZ -氨基酸氨基酸）和失）和失去末端氨基酸残基的多去末端氨基酸残基的多肽，又可与肽，又可与PITC进行偶进行偶联反应，下一轮降解。联反应，下一轮降解。 ATZ-氨基酸不稳定，三氟乙酸氨基酸不稳定，三氟乙酸水溶液水溶液（25%）可转化成稳定的）可转化成稳定的PTH-氨基酸氨基酸。 PTH-氨基酸的氨基酸的鉴定鉴定：可以通过薄层层析、气相色：可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。乙内酰苯硫

5、脲氨基酸乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH氨基酸氨基酸)。PITC试剂试剂ATZ-氨基酸氨基酸单向纸层析单向纸层析氨基酸鉴定氨基酸鉴定PTH-氨基酸氨基酸与标准氨基酸（与标准氨基酸（PITC试剂反应）对照试剂反应）对照 双向纸层析双向纸层析 薄层层析（薄层层析（TLC）3-氨基丙基玻璃氨基丙基玻璃N-(2-氨基乙基氨基乙基)-3-氨基丙基玻璃氨基丙基玻璃惰性载体惰性载体成功的关键是成功的关键是肽段肽段的固定，目前采用的固定，目前采用C端端-羧基固定法羧基固定法，重复法高，重复法高，高丝氨酸高丝氨酸内酯内酯法及法及双异硫氰酯双异硫氰酯法法(DITC)最好，固定率可达最好，固定率可达90-95%。 气相蛋

6、白序列分析仪气相蛋白序列分析仪 6 M HCl，110水解过夜水解过夜 DNS-脯氨酸脯氨酸70%被破坏。被破坏。 Gln Glu， Asn Asp Trp及其及其DNS衍生物衍生物完全被破坏完全被破坏 (可用可用巯基乙烷磺酸巯基乙烷磺酸真空下水解真空下水解)特点：特点： 不能连续降解，适用于不能连续降解，适用于N末端分析末端分析N(CH3)2SO2ClH2N CH CROHN CH CROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HN CH CROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸（n-1）肽荧光？荧光？N肽肽DNS-Cl N末端氨基酸测定末端氨基酸测定Edma

7、n降解除去降解除去N末端氨基酸末端氨基酸水层（水层（n-1）肽）肽乙酸乙酯层乙酸乙酯层（N末端氨基酸衍生物）末端氨基酸衍生物）DNS-Cl N末端氨基酸测定末端氨基酸测定Edman降解除去降解除去N末端氨基酸末端氨基酸DNSEdman测定流程示意图测定流程示意图固定样品固定样品固定固定将蛋白固定在将蛋白固定在高聚纤维素高聚纤维素上，在放在能固定蛋白的上，在放在能固定蛋白的聚偏氟乙烯聚偏氟乙烯（PDVF）膜膜上，进行上，进行Edman降解。降解。反应器反应器耦合耦合以以N-甲基哌啶水甲基哌啶水/甲醇甲醇（TMA）气雾环境让蛋白末端）气雾环境让蛋白末端氨基酸与氨基酸与PITC反应，生产反应，生产P

8、TC-肽肽反应器反应器终止反应终止反应用用乙酸乙酸清洗出去多余的试剂和副产物清洗出去多余的试剂和副产物反应器反应器裂解裂解无水无水TFA溶液，将溶液，将PTC-肽裂解为肽裂解为ATZ -氨基酸和（氨基酸和（n-1）肽，排出并洗涤）肽，排出并洗涤转换器转换器转换反应转换反应采用采用25%TFA溶液将溶液将ATZ-AA转化为转化为PTH-AA转换器转换器提取提取在转换器提取游离的在转换器提取游离的PTH-氨基酸氨基酸样品进样样品进样进样进样用乙腈溶液溶解用乙腈溶液溶解PTH-氨基酸，并进样到氨基酸，并进样到HPLCHPLC分析分析分离鉴定分离鉴定反向反向HPLC分离分离PTH-氨基酸，并检测氨基酸

9、，并检测数据处理数据处理数据分析数据分析显示和处理数据，确定显示和处理数据，确定PTH-氨基酸，并进行定量和氨基酸，并进行定量和回收率计算回收率计算2、C端序列分析程序端序列分析程序六个步骤、六个步骤、羧基活化羧基活化侧链侧链羧基羧基保护保护烷基化烷基化TH肽肽侧链侧链羟基羟基保护保护断裂形成断裂形成ATH-AA AA分析分析C末端测序程序末端测序程序羧基活化羧基活化侧链侧链羧基羧基保护保护烷基化烷基化TH肽肽侧链侧链羟基羟基保护保护断裂形成断裂形成ATH-AA AA分析分析测定测定C端第一个和第二个氨基酸工艺的区别端第一个和第二个氨基酸工艺的区别短肽分离：采用HPLC方法蛋白质分离纯化章节详

10、细介绍方法和原理2、肽链拼接、肽链拼接重叠肽法重叠肽法His-Lys-Ile-Tyr-Lys-Trp-Glu-Asp-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Ala-Cys-Glu X X 射线衍射技术：射线衍射技术：精确精确测定测定原子原子在晶体中的在晶体中的空间位置空间位置的一整套测量及分析技术，的一整套测量及分析技术，是迄今研究生物大分子结构的是迄今研究生物大分子结构的主要技术主要技术。 匡廷云院士匡廷云院士NaCl晶体晶体2. 晶体的基本概念晶体的基本概念2d sin= k (k =1, 2, 3，：掠射角：掠射角)2d cos= k (k =1, 2, 3，：入射角：入射角) 布拉格

11、布拉格X射线衍射原理射线衍射原理布拉格衍射布拉格衍射 布拉格公式布拉格公式 （2 2） 结晶结晶蛋白质的晶体蛋白质的晶体四园衍射仪基本构造四园衍射仪基本构造（3-1）四园衍射仪（全方位测定晶体）四园衍射仪（全方位测定晶体）（3） 衍射及数据的收集和处理衍射及数据的收集和处理X线衍射线衍射l探视物质探视物质微观结构微观结构的一双的一双“锐眼锐眼”！l当一束强光穿过溶菌酶蛋白质晶体，当一束强光穿过溶菌酶蛋白质晶体，l显示器上出现了一幅精细的晶体衍射图像显示器上出现了一幅精细的晶体衍射图像l中国科学院中国科学院“上海光源上海光源”获得了第一幅生获得了第一幅生物大分子晶体衍射图像！物大分子晶体衍射图像

12、！文献来源：文汇报文献来源：文汇报 2009-4-10 记者记者 许琦敏许琦敏富兰克林和她的DNAX光衍射结果 思考题思考题1.原理原理2.适用范围及优缺点适用范围及优缺点3.基本概念基本概念4.核磁共振结构测定基本程序核磁共振结构测定基本程序1永久磁铁永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。扫场线圈。2 射频振荡器射频振荡器：线圈垂直于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。60MHz或100MHz。3 射频信号接受器射频信号接受器（检测器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能级跃迁，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏级信号。4样品管样品管：外径5mm的玻璃管,测

13、量过程中旋转, 磁场作用均匀。 与与UV-vis和红外光谱法类似，和红外光谱法类似，NMR也属于吸收光谱（是也属于吸收光谱（是处于强磁场中原子核对射频辐射的吸收处于强磁场中原子核对射频辐射的吸收1.1.近生理状态溶液中的蛋白质构象测定近生理状态溶液中的蛋白质构象测定2.2.蛋白质分子动力学（在蛋白质分子动力学（在s s到到psps时间尺度上）时间尺度上）3.3.小分子和蛋白质作用的动力学过程小分子和蛋白质作用的动力学过程4.4.蛋白质可变形尾巴部分的构象蛋白质可变形尾巴部分的构象5.5.观察蛋白质结构的运动过程（主侧链运动、不同温度和压观察蛋白质结构的运动过程（主侧链运动、不同温度和压力下蛋白

14、质的折叠和去折叠过程）力下蛋白质的折叠和去折叠过程）6.6.结构定性和定量分析结构定性和定量分析7.7.非损伤性测定法，对样品无破坏作用，但不能太大，溶解非损伤性测定法，对样品无破坏作用，但不能太大，溶解性要好，稳定性要高，不降解不聚合性要好，稳定性要高，不降解不聚合 ，可进行同位素标，可进行同位素标记等。记等。缺点：1. 灵敏度低2. 适用分子量较小的蛋白质3. 基本概念基本概念参数参数/ /概念概念含义含义结构信息结构信息峰位峰位基团的化学势移基团的化学势移二级结构信息，反映微环境变二级结构信息，反映微环境变化化峰形峰形耦合常数及基团间的耦合关系耦合常数及基团间的耦合关系主链和侧链构象变化

15、主链和侧链构象变化峰面积峰面积/ /峰强度峰强度核的相对数量以及弛豫核的相对数量以及弛豫弛豫过程弛豫过程从激化的状态回复到平衡状态从激化的状态回复到平衡状态的过程的过程弛豫时间弛豫时间弛豫过程所需要的时间弛豫过程所需要的时间NOENOE信号强度信号强度质子对间的距离，质子对间的距离，越大反映残基间短程越大反映残基间短程二维同核核磁二维同核核磁共振共振100100以下氨基酸残基数，以下氨基酸残基数， 稳定的溶于水的自然风度的蛋稳定的溶于水的自然风度的蛋白质样品白质样品三维三维/ /四维异核四维异核核磁共振核磁共振大于大于100100以上氨基酸残基数以上氨基酸残基数检测检测1H1H、 13C 13

16、C 、15N15N核之间的核之间的相关相关 共振信号。共振信号。液体核磁共振液体核磁共振13C直接检测、长程NOE信息收集膜蛋白去污剂胶束复合物膜蛋白去污剂胶束复合物( (应用去污剂胶束来模拟膜蛋应用去污剂胶束来模拟膜蛋白的磷脂双分子层环境白的磷脂双分子层环境) )固体核磁共振固体核磁共振只能关注较小分子的结构膜蛋白磷脂复合膜蛋白磷脂复合谱仪频率谱仪频率30MHz900MH30MHz900MH1000MHz1000MHz仪器工作方式仪器工作方式连续波谱仪连续波谱仪脉冲脉冲- -傅里叶变换谱仪傅里叶变换谱仪纯度：不应有铁及其它杂质、粘度要低、纯度：不应有铁及其它杂质、粘度要低、浓度浓度： 5-1

17、0%； 5mg (1H), 15-30 mg(13C)； 傅立叶变换-NMR需1 mg 溶剂溶剂：1H谱= 四氯化碳(1H), 、二硫化碳 氘代溶剂氘代溶剂：氯仿、丙酮、苯、二甲基亚砜的氘代物标样浓度标样浓度（四甲基硅烷 TMS） ： 1%样样 品品1D-2D-3D1D-2D-3D（一级和二级结构（一级和二级结构)计算出三维结构计算出三维结构能量最小化优化能量最小化优化 高分辨率三维结构几何高分辨率三维结构几何碳谱与氢谱的对比碳谱与氢谱的对比碳谱与氢谱的对比碳谱与氢谱的对比谱图去偶作用对比谱图去偶作用对比膜蛋白研究？ 膜蛋白样品中，还包含有去污剂或磷脂分子，这样，膜蛋白样品中，还包含有去污剂或

18、磷脂分子，这样，膜蛋白的膜蛋白的1 1H H信号将和去污剂信号将和去污剂/ /磷脂中的磷脂中的1 1H H信号相重叠，而信号相重叠，而很难获得只含有膜蛋白的很难获得只含有膜蛋白的1H1H信号的核磁光谱信号的核磁光谱在实验过程中，需要采用含在实验过程中，需要采用含1313C C和或和或1515N N标记的膜蛋白标记的膜蛋白，再依靠核磁共振同位素过滤脉冲序列特异性获得膜蛋，再依靠核磁共振同位素过滤脉冲序列特异性获得膜蛋白的信号，并进一步进行膜蛋白的结构研究白的信号，并进一步进行膜蛋白的结构研究 蛋白质通常溶于蛋白质通常溶于pH7pH7、盐离子浓度大约、盐离子浓度大约10-50mmol10-50mmolL L的水溶液中。除了缓冲液必须盐组分，有时还加入少量的水溶液中。除了缓冲液必须盐组分，有时还加入少量的甘油、异丙醇、蔗糖、精氨酸和谷氨酸等，以提高蛋的甘油、异丙醇、蔗糖