常用生物软件软件及引物设计总结PPT学习教案

1、会计学1常用生物软件软件及引物设计总结常用生物软件软件及引物设计总结管理实验室数据及文献资料管理实验室数据及文献资料实验室结果的储存，管理和申报工作。Endnote第1页/共49页分析和处理实验数据和公共数据分析和处理实验数据和公共数据 随着实验的进行，就必须对实验过程中的随着实验的进行，就必须对实验过程中的DNA、RNA和蛋白质的信息进行各种处理，包括和蛋白质的信息进行各种处理，包括限制酶分析、引物设计、同源序列比较、质粒作限制酶分析、引物设计、同源序列比较、质粒作图、结构域图、结构域(motif)查找、查找、RNA二级结构预测、蛋二级结构预测、蛋白二级结构分析、三维结构显示等方面的内容。白

2、二级结构分析、三维结构显示等方面的内容。第2页/共49页第3页/共49页第4页/共49页第5页/共49页第6页/共49页第7页/共49页第8页/共49页第9页/共49页第10页/共49页第11页/共49页第12页/共49页Sense primerAntisense primer选择模板序列保守区域选择模板序列保守区域第13页/共49页第14页/共49页第15页/共49页决定引物退火温度（决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度值）最重要的因素就是引物的长度Tm =（g + C）* 4 +（a + T）* 2第16页/共49页有一些模板本身的有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致

3、引物的含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及含量以及Tm 值保持接近值保持接近（上下游引物的（上下游引物的GC含量不能相差太大）含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。，以有利于退火温度的选择。第17页/共49页一对引物的一对引物的GC含量和含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或倾向或AT倾向则可以在引物倾向则可以在引物5端加适量的端加适量的A、T或或G、C尾巴。若尾巴。若G+C含量太低，可在含量太低，可在5端加上一些端加上一些G或或C，若若GC含量太

4、高，可在含量太高，可在5端加上一些端加上一些A或或T。第18页/共49页两引物之间不应该存在互补性，尤应避免两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。个连续碱基的同源性或互补性。第19页/共49页3端的连续端的连续3 3个个G 或或C ，如如GGG或或CCC，会导致引物在会导致引物在G+CG+C富富集序列区错误引发集序列区错误引发第20页/共49页n（如生物素、地高辛等）。双酶切位点，有利于定向克隆，2-3个保护碱基，一般加CG。计算引物Tm

5、 值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。第21页/共49页 若模板不很清楚，引物若模板不很清楚，引物3端最后一个碱基最好为端最后一个碱基最好为T，其次其次是是G或或C，而不选而不选A，国外资料表明，当末位为国外资料表明，当末位为T时，即使在时，即使在错配的情况下也能引发链的合成，而末位为错配的情况下也能引发链的合成，而末位为A时，错配时引发时，错配时引发大大降低，大大降低，G G或或C居中，可见，模板很清楚时选居中，可见，模板很清楚时选A可以提高特可以提高特异性异性。第22页/共49页G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性（

6、结合的强弱程度结合的强弱程度）。一般情况下，一般情况下，引物的引物的GG值最好呈正弦曲线形状，即值最好呈正弦曲线形状，即55端和中端和中间间GG值较高，而值较高，而33端端GG值相对较低，且不要超过值相对较低，且不要超过9 9 （绝对值，一般考虑末端5个碱基的G。此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则3末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位引发。因此在复杂模板的扩增体系中，3末端5聚体的Gkcal/mol） ，如此则有利于正确引发反应而可防止错误，如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。引发。引物的3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（能值越高越容易结

7、合）33末端双链的末端双链的GG是是0 02 2 kcal/molkcal/mol时，时，PCRPCR产量几乎达到百分之百，产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在6 6时只有时只有40%40%、到、到8 8时少于时少于20%20%、而、而1010时接近于时接近于0 0。第23页/共49页 选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有重复序列 好的设计工具会提供一个引物异位引发的评价指标，好的设计工具会提供一个引物异位引发的评价指标，如如Oligo 6.0 Oligo 6.0 的的false priming efficiencyfalse pr

8、iming efficiency，即异位引即异位引发效率，这个值是由程序根据引物自身二级结构的能量、发效率，这个值是由程序根据引物自身二级结构的能量、错配的类型、错配离错配的类型、错配离33末端的距离等因素综合计算而得出末端的距离等因素综合计算而得出，当此值大于，当此值大于200200时便很有可能引发扩增。如所用工具无时便很有可能引发扩增。如所用工具无量化指标，则可依据经验，当引物与模板在非预期位置退量化指标，则可依据经验，当引物与模板在非预期位置退火，超过火，超过70%70%的碱基能互补配对，或引物的碱基能互补配对，或引物33末端连续末端连续8 8个个或以上碱基配对，则认为有引发的可能。或以

9、上碱基配对，则认为有引发的可能。第24页/共49页第25页/共49页参数设置默认引物长度 - 默认值为25引物对搜索最大值 - 默认值为100核酸浓度 -默认值为250 pM单价离子浓度 - 默认值为50 mM游离Mg2+离子浓度 - 默认值为1.5 mM评分参数Rating parameters 评分参数窗口是用来设定二级结构在引物评分中的权重系数二级结构越稳定引物评分就会越低相对于在引物中间形成的二级结构来说3 末端的二级结构对PCR扩增的影响会更大为了将这一效应计算在内软件将3 末端的二级结构的自由能数值G减去1 这一修正会使3 末端的二级结构显得更加稳定第26页/共49页第27页/共4

10、9页比对软件和方式多，这里演示下Omiga，和primer第28页/共49页Preimer Premier 启动界面第29页/共49页粘贴序列窗口这一窗口使得一段核酸序列通过选择以四种不同的方式粘贴上去（CTRL-V）第30页/共49页Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好Choose a function 第31页/共49页First you can design the

11、primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primer第32页/共49页引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置范围产物大小范围引物长度第33页/共49页第34页/共49页28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物第35页/共49页回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer第36页/共49页第37页/共49页Edit primer hereAnalysis the edit resultAccept the edit result Return to the main window第38页/共49页Open sequence file第39页/共49页第40页/共49页G Internal Stability第41页/共49页Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频