琼脂糖凝胶电泳常见问题

1、琼脂糖凝胶电泳常见问题常见问题原因对策DNA条带模糊DNA降解实验过程避免核酸酶污染电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度 降低，PH值上升，缓冲能力减弱， 从而影响电泳效果。TBE建议使用10次就更换缓冲液所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过 20V/CM,温 度V 30C，巨大DNA链电泳，温 度应v 15 C,核查所用电泳缓冲液 的缓冲能力，注意经常更换DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量DNA含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐 分有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白DNA变性电泳前勿加热，用 20mM Nacl缓 冲液稀释DNA出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或 片状带

2、或地毯样带。其原因往 住由于酶里过多或酶的质里 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓 度过高，退火温度过低，循环 次数过多引起。其对策有：减少酶重，或调换 另一来源的酶。减少dNTP的 浓度。适当降低 Mg2+浓 度。 增加模板量，减少循环次数。不规则DNA带迁移电泳条件不合适电泳时电压不应超过 20V/CM,温 度V 30C，巨大DNA链电泳，温 度应v 15 C,核查所用电泳缓冲液 的缓冲能力，注意经常更换DNA变性电泳前勿加热，用 20mM Nacl缓 冲液稀释DNA带弱或无DNA带DNA上样量不够增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝 胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高， 上 样量可适当降低DNA降解实验

3、过程避免核酸酶污染DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝 胶浓度EB染色的DNA,所用光源不合适应用短波长（254nm）的紫外光源DNA带缺失DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝 胶浓度分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确凝胶浓度DNA变性电泳前勿加热，用 20mM Nacl缓 冲液稀释DNADNA链巨大，常规凝胶电泳不合适在脉冲凝胶电泳上分析电泳时Ladder扭曲配胶的缓冲液和电泳缓冲液不是 同时配置同时配置，电泳缓冲液高出液面1-2mm即可电泳时电压过高电泳时电压不应超过 20V/CM1矗胶制作1.1凝胶浓度配制凝胶的浓度据实验需要而变，一般在08%2.0%之

4、间，如果一次配制 凝胶100 ml,没用完的凝胶可以再次触化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，褫胶浓 度则会越来越高，导致实验结果不稳定，补水办法一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后 补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重.煮胶后补充水至点重量。粗略一点的方法是通 过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值*以保证凝胶浓度基本维持在原浓度,核酝染色 剂澳化乙锭(ethidium brom应河加在融化的琼醐中，终浓度为5 fg/mh也可在电泳结 束后染色。1、2梳板的选用TR每个制胶模具均配有多个齿型不同的椅板，梳齿宽厚，形成的点样孑L容 积较大,用于DNA片段回收实验等，相反，槐齿窄而薄

5、 形成的点样孑L容积就较小，用于 PCR产物、酶切产物鉴定等。梳板的选择主要是看上样量的多少而定，一殷来说，上样量小时 尽量选S薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析°另外，每次制胶时都要注意 梳齿与底板的距离至少mm.否则，拔梳相时易损坏凝胶孑L底层，导致点样后样品渗漏， 当然，点样孑L的破坏还与拔梳板的时间和方法有关.一般稀胶需拎却30 mintt上方可拔楹私 应急的情况下可以将成型的凝胶块放4V冰箱中待却15 Ein左右，拔梳板的方法是将制胶槽放 置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润:滑作用，梳板易拔出 且不易损坏点样孑L“2点样点样需加上

6、样缓冲液，因为上样缓冲液中加了甘油或蔗糖增加密度，使样品机入孑L底；指示 样品的迁移过程，上样缓冲液中TK加了两种指示剂，澳酚兰和二甲苯青(值得注意的是指示剂 并非染色剂，DNA染色剂是溟化乙锭，而且要在紫外光的激发下才能看见桔红色荧光卜上样缓 冲液储存液一般为6*(10),表示其浓度为工作浓度的六倍，使用时上样缓冲液应稀释到一倍 浓度。点样方法是将移液器基本垂直点样孑L,用另一只手帮助固定移液器下端，移液器枪头(Tip漆端进入点样孑L即可将样品注入孑L内，千万不可将Tip尖插至孑L底，并点上适合的DNA 分子量标准，所谓适合是指样品DNA分子量大小应基本在DNA分子量标准范围之内。3电泳将电

7、泳仪的正极与电泳槽的正极相连，负极与负极相连，核酸带负电荷，从负极向正极移动。 电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同，电泳缓冲浅刚好没过摄胶1mm为好,电泳 缓冲液太多则电流加大，凝胶发热。电泳时摄胶上所加电压一般不超过5v/cm(指的是正负电 极之间的距离，而不是凝胶的长度)，电泳时间一般为3060 min,根据实验需要也可作适当 调整，电压增高，电泳时间缩短，核酸条带相对来说不够整而 不够清晰；相反，电压降低， 电泳时间较长，核酸条带整齐清晰。另外，如果电泳后样品泳动很慢或者没泳动，请检查胶模 两端的封口胶条是否已去掉。4结果分析较成功的电泳结果是分子量标准条带整齐清晰，样品条带也整齐清晰，如果条带模糊暗淡，单 从琼脂糖凝胶电泳角度来说，可能的原因：漠化乙锭的质和量怎样碧臭化乙锭见光易分解，母 液配制时间过长或保存不当(一般4C避光保存一年内有效)，或者终浓度没达到0. 5vg/ml； 电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，一般用23次就要更换， TBE缓冲液则可使用1嗽左右。实际工作中经常发现DNA分子量标准小片段模糊不清，那足因为琼脂糖凝胶浓度一般不会超过 2 0%,较小的核酸片段在它的分辨