病毒转染原理及步骤

1、病蠹转染原理及步骤在细胞相关的实验操作中，对丁一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病蠹介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。病蠹转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病3感染靶细胞。以慢病蠹 为例。慢病蠹(Lentivirus)载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病蠹)为基础发展起来 的基因治疗载体。区别一般的逆转录病蠹载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具 有感染能力。慢病蠹载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将 外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可 有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细

2、胞、干细胞等多 种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究， 效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。一、慢病蠹载体构建原理：慢病蠹载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病蠹颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、 逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及 在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞， 即可在细胞上活中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病蠹载体颗粒。慢病蠹表达载体包含了包装、转染、

3、稳定整合所需要的遗传信息。慢病蠹包装质粒可提供所有的转录并包装 RNA到重组的假病蠹载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病蠹颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞， 在细胞中进行病蠹的包装，包装好的假病蠹颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心 取得上活液后，可以直接用丁宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后， 经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。对丁一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi , cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。对进行稳转 细胞株

4、的筛选，为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病蠹液提供基二、慢病蠹载体构建及包装流程：（一）实验流程（1和2为并列步骤）1. 慢病蠹过表达质粒载体的构建设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点,PCR（采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%）从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因 CDS区（coding sequence连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装 入慢病蠹过表达质粒载体。2. 慢病蠹干扰质粒载体的构建合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病蠹干扰质粒载体3. 慢病蠹载体的包装与浓缩纯化制备慢病蠹穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行 高纯

5、度无内蠹素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h更换为完全培养基， 培养24和48h后，分别收集富含慢病蠹颗粒的细胞上活液，病蠹上活液 通过超离心浓缩病蠹。（二）实验材料：慢病蠹载体、包装细胞和菌株该病蠹包装系统为三质粒系统，组成为 pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中质粒上的 ZsGreenl表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP细胞株293T,慢病蠹的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培 养基为DMEM（含10% FBS）。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。菌株大肠杆菌菌株DH成。用丁扩增慢病蠹载体和辅助包装载体质粒。（一）慢病

6、蠹转染贴壁细胞实验方法1、慢病蠹转染前18-24小时，将贴壁细胞以1X05/孔铺到24孔板中。使细胞在 慢病蠹转染时的数量为2X105/孔左右。2、第二天，用含有6 H g/ml polybrene 2ml新鲜培养基替换原培养基，加入 适量病蠹悬:液。37 C孵育。3、（对polybrene蠹性敏感的细胞选作此步骤）4小时后加入2ml新鲜培养基以 稀释 polybrene。4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病蠹的培养基。5、 继续培养。如果慢病蠹含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率，可在转染后 72-96小 时进行。如果慢病蠹含

7、有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。（二）慢病蠹转染悬:浮细胞实验方法1、在2X105/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 g/mB适量病蠹，充分混匀。37C孵育。或者150g室温离心4小时（选作，部分难转染的细胞系采用此步 骤可以提高转染效率）。2、（对polybrene蠹性敏感的细胞选作此步骤）4小时后（或离心结束后）加入等 体积新鲜培养基以稀释polybrene。3、继续培养3-4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。病蠹感染细胞本来效率就较低，一定要注意以下几点：1.感染时的培养基尽量少些；2.每1ml的培养基中加入 5-10ul的Polybrene （储存液浓度为2mg/ml ）,可 以提高效率约3-5倍。不过病蠹感染效率的问题都是相对的，达到自己的研究目 的即可。北京英格恩生物公司最新研发合成一种新型纳米聚合物病蠹感染增强试剂（病 蠹转染试剂）EnvirusTM,具有对病蠹吸附和独有的浓缩功能。EnvirusTM通过物理 作用将病蠹大量富集在细胞表面，大大增加病蠹与细胞的接触，最大限度促进病 蠹感染细胞，可大大提高腺病蠹，慢病蠹，腺相关病蠹，逆转录病蠹等病蠹的感 染效率，并且细胞蠹性很小。通常情况下，比不用 EnvirusTM增强剂，提高感染 效率20-50倍。virus only virus+Polybrene viru