王镜岩生物化学15DNA复制和重组考研必备学生物化学必备PPT学习教案

1、会计学1王镜岩生物化学王镜岩生物化学15DNA复制和重组考研复制和重组考研必备学生物化学必备必备学生物化学必备*It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material. 一、DNA的复制第1页/共95页（一）DNA的半保留复制 第2页/共95页DNA半保留复制的实验证据1958 年Meselson和 Stahl的实验第3页/共95页（二）DNA复制的起点

2、和方式 型复制第4页/共95页D环复制滚环复制真核rDNA的扩增，F因子DNA的转移，裂解途经的复制，X174，M13，G4等单链环状DNA噬菌体 第二阶段复制都是滚环复制。线粒体DNA为D环复制第5页/共95页 1956年 Kornberg发现的DNA聚合酶I（100kg大肠杆菌可以分离0.5g纯化的酶）由一条肽链组成，有53聚合酶活力， 53外切酶活力，和3 5外切酶活力。用蛋白酶水解得到的Klenow片段有3 5外切酶活力和5 3聚合酶活力。（三）DNA聚合反应有关的酶 DNA聚合酶催化的反应Protease cleavage DNA polymerase I has three enz

3、ymatic activities in a single polypeptide chain, which can be cleaved into two functional parts by mild protease treatment.第6页/共95页图示为 Klenow片段与DNA的结合，模板链(12nt)为蓝色，引物链(14nt)为红色。DNA聚合酶I的Klenow片段与DNA的相互作用第7页/共95页 DNA聚合酶I的53外切酶可以从单链切口的5 末端切除核苷酸， 5 3 聚合酶可以用脱氧核苷酸填补缺口。DNA聚合酶I的校对作用第8页/共95页第9页/共95页第10页/共95页

4、DNA聚合酶 的结构第11页/共95页DNA聚合酶的亚基二聚体与DNA结合的空间关系 (顶部观)。DNA聚合酶的亚基二聚体与DNA结合的空间关系(立体图)。DNA聚合酶有不少于7个亚基，可能参与DNA的修复，1999年发现的DNA聚合酶和可以复制有较多损伤的DNA。第12页/共95页DNA连接酶的作用机制细菌的DNA连接酶以NAD为能源，动物细胞和噬菌体的连接酶以ATP为能源。T4的DNA连接酶可以连接平末端。第13页/共95页（四）DNA的半不连续复制 从寻找失踪的酶到同位素脉冲标记发现冈崎片断从寻找失踪的酶到同位素脉冲标记发现冈崎片断第14页/共95页（五）DNA复制的拓扑性质 拓扑异构酶

5、可以消除负超螺旋，对正超螺旋无作用。 拓扑异构酶可以在消耗ATP的条件下连续的引入负超螺旋，在无ATP消耗的条件下，可以松弛负超螺旋。 真核生物的拓扑异构酶可以消除负超螺旋，也可以消除正超螺旋。 真核生物的拓扑异构酶（分为和两种）可以消除负超螺旋和正超螺旋，但不能引入负超螺旋。 拓扑异构酶主要和转录有关。 拓扑异构酶主要与复制有关。 拓扑异构酶引入负超螺旋可以消除复制叉前进时带来的扭曲张力。 双螺旋的解开需要解螺旋酶参与。DnaB是一种解螺旋酶，沿模板链的5 3 方向移动，由ATP供能，可能参与复制。解螺旋酶、和沿模板链的5 3方向移动，rep蛋白沿3 5方向移动，这几种解螺旋酶可能与修复作用

6、有关。 SSB可以稳定单链，与单链的结合有协同效应。第15页/共95页第16页/共95页复制的起始（六）DNA复制的过程 第17页/共95页大肠杆菌DNA复制的步骤第18页/共95页大肠杆菌DNA复制时冈崎片段的合成步骤第19页/共95页复制的延伸第20页/共95页第21页/共95页复制的终止第22页/共95页第23页/共95页（七）真核生物DNA的复制 DNA replication in eukaryotic cells use essentially the same principles but being more complex in the details. The best u

7、nderstood eukaryotic replication system is that of SV40 and yeast. Formation of the RNA primers and the initial incorporation of deoxynucleotides are believed to be catalyzed by DNA polymerase (which has no proofreading activity). Later chain extension is believed to be catalyzed by DNA polymerase ,

8、 which has proofreading activity and is clamped onto the DNA templates via the PCNA trimer rings.第24页/共95页 Specific sequences (150 bp) that can function as replication origins have only been identified in yeast ( is called autonomously replicating sequences, or ARS) and SV40 virus. The rate of DNA s

9、ynthesis in eukaryotic cells is about one tenth of that of the E.coli cells. Replication in the eukaryotic genomes begin at many replication origins. 9 purified proteins are needed to replicate SV40 virus DNA in vitro. T antigen：a multifunctional site-specific DNA binding protein encoded by SV40 DNA

10、, binds to the origin (as DnaA) and melts the duplex DNA (as DnaB);第25页/共95页 RPA： encoded by the host mammalian cells and binds to the melted single-stranded DNA (as SSB). Pol /primase： synthesizes the RNA primers and a stretch of DNA sequences, has no proofreading activity. Pol replaces Pol /primas

11、e to further extend the RNA-DNA strand, has proofreading activity. PCNA (proliferating cell nuclear antigen)： a trimeric ring-shaped protein that clamps Pol onto the DNA template. RFC (replication factor C)： a clamp loader for PCNA. Topoisomerases： Relieves the torsional strain induced by the growin

12、g replication fork. Ligases：joins the Okazaki fragments (which is much shorter than those in E.coli cells), as well as the leading strand.第26页/共95页 几种真核细胞的DNA聚合酶的性质如表表中所示，体外或者是体内的实验均证明， DNA聚合酶和可以被抑制剂23-双脱氧胸苷和蚜肠霉素抑制，这些结果可以说明它们是DNA的复制酶。 DNA聚合酶主要是用来起始链的合成，而DNA聚合酶则是用来延伸新生成的链的。另外两种DNA聚合酶和，则主要是用来参与修复反应的。而

13、DNA聚合酶则是负责线粒体DNA的复制的。第27页/共95页E.coli SV40/人 酵母 功能DnaA O T抗原 ORC 起始蛋白DnaB DnaB T抗原 MCM 解旋酶DnaC P ? Cdc6 装配因子DnaG DnaG Pol-引发酶 Pol-引发酶 引发酶 Pol的 亚基 Pol Pol,Pol 聚合酶 Pol的亚基 Pol Pol,Pol 校正 Pol的亚基 PCNA(增殖核抗原) PCNA 滑动钳 复合体 RF-C RF-C 滑动钳装配器 SSB RF-A RF-A 单链结合蛋白原核和真核生物复制体系的比较第28页/共95页Model of in vitro replica

14、tionof SV40 DNA by eukaryotic enzymes:1. T antigen (Tag) binds and unwinds replication origin;2. RPA (or RFA) binds to single-stranded DNA;3. Pol -primase synthesizes the primers (RNA + DNA).第29页/共95页4. RFC loads PCNA to the template.5. PCNA displaces Pol-primase and functions as a DNA clamp;6. Pol

15、replaces Pol-primase and further extends the DNA strands.第30页/共95页酵母的自主复制区 多个ARSARS(autonomously replicationg sequence)发挥复制起点的功能。 酵母染色体的着丝粒附近为ARS1序列，ARS1分为A,B,C三个功能区, A,B起主要作用,C起次要作用。A区为15bp,其中11个保守，称ACS (ARS consensus sequence)。有复制起始子的功能。B区约为80bp,含B1,B2,B3三个功能区。B3是ABF1（ARS-binding factor 1）结合区。 ORC

16、ORC(origin recognizing complex)：由6个亚基组成相当于DnaA和的O蛋白，与A/B1结合后结合于游离的DNA。 Cdc6Cdc6:相当于DnaC,及的P蛋白，使Mcm蛋白结合到复合体上。这对于在Origin上起始复制是必须的。 McmMcm: DnaB螺旋酶。即 licensing factor ABF1ABF1：（转录因子）结合于B3第31页/共95页酵母DNA复制的起始起点辨认复合体由酵母cdc6基因编码的复制激活体蛋白小染色体维持蛋白（复制许可因子）周期蛋白-周期蛋白依赖性蛋白激酶 由酵母cdc7,dbf4基因编码的另一种蛋白激酶前复制复合体后复制复合体第3

17、2页/共95页PCNA（增殖细胞核抗原）三聚体的结构与原核生物DNA聚合酶 的亚基二聚体相似。第33页/共95页真核生物DNA复制的模式复制蛋白A复制因子C(a)前导链的合成由DNA聚合酶起始，然后RFC除去DNA聚合酶，结合PCNA和DNA聚合酶（图中未示出），滞后链的合成由DNA聚合酶起始合成引物，然后由RFC装载PCNA和DNA聚合酶（或），合成冈崎片段。（b）当DNA聚合酶接近下游冈崎片段的RNA引物时，RNase H1降解RNA引物到最后一个核苷酸，最后一个核苷酸由FEN1/RTH1切除，连接酶连接两个冈崎片段断。第34页/共95页滞后链末端的引物被切除后会形成缺口端粒酶可以加长DN

18、A的末端第35页/共95页第36页/共95页二、DNA的损伤修复 (一) 错配修复 大肠杆菌的Dam甲基化酶可以使DNA的GATC序列中A的N6甲基化，新合成的链在短期内未能甲基化，如果有错配碱基对，则需切除新合成链的错配区，MutS二聚体识别并结合到错配碱基部位，mutL二聚体与MutS结合，使DNA形成突环，复合体随ATP水解而移动，直至遇到GATC序列，随后核酸内切酶MutH结合到MutSL上，将未甲基化链GATC位点G的5端切开，若切开处位于错配碱基的3侧，则由核酸外切酶或核酸外切酶X沿3 5方向切除核酸链。若切开处位于错配碱基的5侧，则由核酸外切酶或RecJ沿5 3方向切除核酸链,新

19、的DNA链由DNA聚合酶和连接酶合成并连接。在切除链的过程中，解螺旋酶和SSB帮助链的解开。 人类的hMSH2和hMLH1基因编码的蛋白质分别与大肠杆菌的MutS和MutL相对应，错配修复的过程与与大肠杆菌相似。第37页/共95页第38页/共95页第39页/共95页切开处位切开处位于错配碱于错配碱基的基的3侧侧切开处切开处位于错位于错配碱基配碱基的的5侧侧第40页/共95页(二) 直接修复 胸腺嘧啶二聚体的形成 从单细胞生物到鸟类都存在光复活酶，但高等哺乳动物却没有光复活酶，其胸腺嘧啶二聚体需要通过切除才能修复。第41页/共95页(三) 切除修复 第42页/共95页(四) 重组修复第43页/共

20、95页第44页/共95页(五) 应急反应(SOS)和易错修复 重组蛋白A，在有单链DNA和ATP存在时被激活，并促进LexA的蛋白水解酶活性，因而可被称作辅蛋白酶。LexA的分解使umuDC基因表达DNA聚合酶V，dinB基因表达DNA聚合酶， uvrA,B,O分别表达切除酶的亚基，此外，促进一些其他基因的表达，使有差错的基因可以复制，并在随后被修复。第45页/共95页LexA是多种是多种基因的抑制剂基因的抑制剂第46页/共95页第47页/共95页第48页/共95页 三、DNA的突变 (二)诱变剂的作用 1.碱基类似物:如5-溴尿嘧啶，酮式与腺嘌呤配对，稀醇式与鸟嘌呤配对，结果使A-T变为G-

21、C，相反则可将G-C变为A-T。（一）突变的类型 1.碱基对的置换：两种嘌呤或两种嘧啶之间的互换称作转换；嘌呤与嘧啶之间的互换称作颠换。引起氨基酸改变称作错义突变；氨基酸密码子变为终止密码子称作无义突变；不引起氨基酸改变称作中性突变。 2.移码突变：一个或多个非三整数倍核苷酸的插入引起阅读框的改变，通常使基因产物完全失活，出现终止码会使翻译提前终止。第49页/共95页 2-巯基嘌呤是腺嘌呤的类似物，通常与胸腺嘧啶配对，以罕见的亚氨基状态存在时，可以与胞嘧啶配对，使A-T变为G-C，相反则可将G-C变为A-T。第50页/共95页2.碱基的修饰剂第51页/共95页 3.嵌入染料：如丫啶类，原黄素，

22、溴化乙锭等可插入碱基对之间，引起核苷酸的插入或缺失。 4.紫外线和电离辐射：紫外线可以使相邻嘧啶之间形成环丁烷结构的二聚体；电离辐射产生的自由基可以使核苷酸链断裂。自由基可以破坏糖环，打断多核苷酸链。第52页/共95页形成错配碱基对的机制第53页/共95页(三)诱变剂和致癌剂的检测 某些调节正常细胞分裂的基因，突变后会使细胞生长失控成为肿瘤，这样的基因突变前称作原癌基因，突变后称作癌基因。抑癌基因可以抑制细胞的恶性生长，突变后会使癌症的发病率增加。 Ames实验是检验致癌剂的常用方法，将鼠伤寒沙门氏杆菌组氨酸营养缺陷型菌株接种到含待测物的无组氨酸培养基平皿中，若待测物含有诱变剂，可发生恢复突变

23、，长出的菌落多少可以反映诱变剂的强弱。 大肠杆菌的SOS反应可以使溶原态的噬菌体激活，使宿主菌裂解产生噬菌斑，引起细菌SOS反应的化合物对高等动物都是致癌的，用这一方法检测致癌剂，可以大大简化检测方法。第54页/共95页基本要求1.掌握原核生物DAN复制的有关酶和复制过程。（重点）2.掌握真核生物DAN复制的特点。（重点）3.掌握DNA损伤修复的机制。（重点）4.熟悉DNA突变的产生机制。第55页/共95页DNA的重组 第35章第56页/共95页(一) Holliday模型 一、同源重组第57页/共95页(二) 细菌的基因转移与重组 细菌的结合作用 致育因子（F因子）通过结合作用由F+细胞向F

24、-细胞转移，F质粒约1/3的基因与转移有关，traS和traT基因编码表面排斥蛋白，阻止F+细胞之间的转移，F+细胞的性菌毛与F-细胞结合后收缩，使二者靠近，TraD蛋白构成转移的通道，在TraI在TraY的帮助下结合到转移起点oriT上，切开一条链，使其5端进入受体细胞，并合成其互补链，使F-细胞转化为F+细胞，给体细胞中的单链也可以合成互补链。第58页/共95页 在细菌基因转移的不同时间将配对细胞分开，可以确定基因在染色体上的位置。F质粒DNA可以通过重组整合到受体的染色体中，使受体菌成为高频重组（Hrf)菌株，若F质粒的DNA未能完整地进入受体菌，则受体菌不能转化为F+, F质粒的DNA

25、可以被切割出来，有时可携带宿主菌的染色体DNA，称作F因子， F因子携带的基因可在受体菌表达。第59页/共95页大肠杆菌染色体的基因图 外源基因可以进入感受态细菌，称作转化，自然条件下感受态的形成需要10多种蛋白质参与，实验室常用高浓度的Ca2+处理使细菌形成感受态。 通过噬菌体将细菌基因从供体菌转移到受体菌称作转导，若宿主菌任意部位的基因取代噬菌体DNA的一部分转入受体菌，称作普遍性转导，若宿主整合部位的DNA取代了噬菌体的部分DNA称作限制性转导。进入受体菌的基因可与染色体重组。 用溶菌酶除去细菌的细胞壁，人工促使原生质体融合，可引起广泛的重组。第60页/共95页噬菌体的基因重组第61页/

26、共95页(三) 重组有关的酶 依赖RecBCD起始的重组模型: RecBCD有依赖ATP的核酸外切酶、核酸内切酶和解螺旋酶活性，当DNA断裂时，它结合在其游离端，使其解旋并降解，直至酶移动到chi位点（GCTGGTGG)，在其3侧4-6核苷酸处将链切断，产生3游离单链，随后单链与RecA结合，开始同源区重组。第62页/共95页RecA蛋白的丝状聚合体与DNA的相互作用RecA蛋白的带状图解 RecA蛋白的丝状聚合体，每一圈螺旋由6个RecA蛋白单体构成，其中一个单体由红色标出。第63页/共95页RecA蛋白引起DNA同源重组的模型第64页/共95页 在大肠杆菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋

27、白参与的同源重组。 （a a） RuvA四聚体的图解。四个亚基形成的结构像四个花瓣的花。 （b b） RuvA/RuvB的作用： （左）RuvA四聚体结合到Holliday位点； （中）RuvB六聚体结合到杂合双螺旋的两对面，DNA穿过其中心， RuvB六聚体的作用像马达，促进超螺旋分叉点通过复合体移动。 （右）RuvC结合到Holliday位点，由其核酸酶活性切断核酸链，切割位点由剪切体辨认。 （c c） RuvA四聚体的电荷分布，蓝色表示正电荷，红色表示负电荷，注意正电荷位于四聚体的表面，有四个负电荷区域位于其中心。 （d d） 假设的RuvA四聚体与Holliday位点结合的结构模型。第

28、65页/共95页二、特异位点重组第66页/共95页第67页/共95页细菌的特异位点重组沙门氏菌两种鞭毛蛋白表达的调控第68页/共95页免疫球蛋白基因的重组IgG的分子结构第69页/共95页（1）（2）（3）（4）（5）第70页/共95页重组位点有7和9nt的信号序列,中间间隔12或23bp。第71页/共95页免疫球蛋白基因重组的模型重组酶（RAC1/RAC2)复合体与重组信号序列结合复合体使编码序列与重组信号序列之间的双连断裂，编码序列的末端形成发夹结构。重组信号序列结合形成环状结构。编码序列连接前经过加工，连接位点不十分确定，增加了免疫球蛋白的多样性。DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)和D

29、NA连接酶参与了加工和连接过程。9碱基序列7碱基序列第72页/共95页在不同的核苷酸位点重组可以生成不同的蛋白质第73页/共95页三、转座重组 McClintock的重要发现第74页/共95页 转座子具有反向末端重复序列以及在靶部位两侧产生的同向重复序列。在该例中靶序列为5bp，转座子末端由9bp反向重复序列组成，数字1-9指序列重复碱基对。*两侧正向重复两侧正向重复*末端反向重复末端反向重复*(一) 细菌的转座因子1.插入因子第75页/共95页2.组合型转座子：两个插入序列之间夹着一段序列（可以是某个基因，如抗性基因）。两个插入序列可以同向或反向排列，有时均有转座活性，有时只有一个有转座活性

30、。3.复合型转座子：插入序列被转座酶基因取代，图示为Tn3(TnA家族）的结构。两端为38bp的反向重复，其两侧为5bp的靶序列，tnpA编码转座酶，tnpR编码的蛋白质可以作为解离酶（使转座子与受体DNA形成的共整合体重组和解离），也可以作为阻遏蛋白调节tnpA和tnpR两个基因的表达，res为解离的控制位点，TnpR蛋白结合于其上发挥调控作用。第76页/共95页两个IS10组件构成一个复合转座子，它能使位于他们之间的任何DNA易位。当Tn10是一个小的圆形分子的一部分时，IS10重复序列可转座至环状分子的任一侧。4.转座的方式转座子可用不同的方式转座，转座因子插入基因后可使基因失活，也可引

31、起染色体的断裂、重复、缺失、倒位、易位等变化。第77页/共95页 插入序列使靶序列的数量增加，在插入序列两侧各有一个。第78页/共95页复制转座作用产生了转座子的一个拷贝，它插入到一个接受位点。给予位点保持不变，以致给予者和接受者都有转座子的一个拷贝。 第79页/共95页 非复制转座作用在未被修复的情况下，可能造成致死突变。第80页/共95页 保守的转座作用不造成核苷酸的丢失，如噬菌体的整合和切除。第81页/共95页 转座子引起DNA的重排，正向重复序列的重组引起其间序列的切除或插入。第82页/共95页 反向重复序列的重组能引起其间序列反向排列。第83页/共95页 转座作用可引起给体和受体的整

32、合或分割，并可引起转座子拷贝数的增加第84页/共95页(二) 真核生物的转座因子 原核生物的转座酶主要作用于产生它的转座因子，表现出顺式显性。真核生物的转座酶可以作用于任何末端具有该酶所识别的反向重复顺序的DNA,使其转移到相应的靶位点。 在玉米的激活-解离系统（activator-dissociation system, Ac-Ds)中，Ac编码转座酶(自主因子)，Ds（非自主因子）是Ac不同程度的缺失中间序列形成的，无转座酶活性，但随Ac转座后可抑制邻近基因的表达。 在玉米的抑制-促进-增变系统（suppressor-promotor-mutator,Smp)中,Smp和En（增强子）序列

33、相似，均为自主因子，与其对应的非自主因子dSmp为有缺陷的Smp因子，转座后，若Smp插入靶基因附近的合适部位，可以促进靶位点基因的表达，若Smp插入外显子，可抑制基因的表达。第85页/共95页第86页/共95页玉米的控制元件形成转座子的不同家族，每个家族均有自主和非自主成员。第87页/共95页P品系的果蝇含有40-50个P因子（一种转座子）， P因子的mRNA前体含有3个内含子，若P品系雄性与M品系雌性交配，子一代的体细胞mRNA前体加工时保留了第3个内含子，合成阻遏蛋白，不发生转座，性细胞mRNA前体加工时切除了全部3个内含子，活跃的转座使性细胞失去功能。P雄性或M雄性与P雌性交配时，由于

34、雌性的卵细胞质中存在抑制P因子转座酶活性的蛋白质，子代的生殖功能正常。第88页/共95页四、真核生物基因表达的转录前调控 1.染色体丢失:如四膜虫的大核为营养核，由小核发育而来，约10%的DNA在发育过程中被丢失。 2.基因扩增：如非洲爪蟾卵母细胞的rDNA可以大量扩增，形成1000个以上的核仁。 3.基因重排:重排可以使表达的基因发生切换，也可以产生新的基因。 4.组蛋白的乙酰化和去乙酰化：组蛋白的乙酰化和基因表达的状态相关。组蛋白H4的乙酰化不足(underacetylation)是雌性哺乳动物一条X染色体失活的原因之一。去乙酰化和基因活性的阻遏有关。 5.染色体DNA的修饰和异染色质化：

35、DNA的甲基化可以使其失去转录活性，高度甲基化的DNA可以形成高度压缩的异染色质，异染色质的基因无转录活性。第89页/共95页6.染色质结构改变模型-组蛋白置换 占先模型(pre-emptive model)：决定的因素是转录因子和组蛋白谁先占据调控位点。DNA复制时，组蛋白8聚体解离，转录因子乘机结合到调控位点上，一直持续到下一个复制周期，抑制了组蛋白和DNA的结合。 例1：当5S rRNA基因与组蛋白结合时TFA不能激活此基因。而TFA可与游离的5S rRNA基因结合，再加入组蛋白不能使此基因失活。 例2：含腺病毒启动子的质粒能被TFD结合，再被RNA pol 转录，如先加入组蛋白，则不起始转录，如先加入TFD则形成的染色质中，模板仍能转录。 动态模型(dynamic model) ：组蛋白置换需输入能量。一些转录因子结合DNA时可裂解核小体，或建立一个可产生核小体定位结合位点的边界