基因文库的建立

1、第四章第四章基因文库的建立基因文库的建立基因文库基因文库(genelibrary)基因组文库基因组文库(genomiclibrary)cDNA文库文库(cDNAlibrary)第一节第一节基因组文库的构建基因组文库的构建定义：定义：含有某种生物全部遗传信息的重组含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。分子的克隆总和。一一.基因组文库的规模基因组文库的规模N基因组文库克隆总数基因组文库克隆总数P所需机率所需机率N=f插入片段与基因组插入片段与基因组DNA长度之比长度之比二建立基因组文库的一般程序二建立基因组文库的一般程序1载体载体DNA片段的制备片段的制备DNA分离纯化分离纯化限制酶

2、切限制酶切脱磷酸化反应脱磷酸化反应2供体供体DNA片段的制备片段的制备总总DNA分离纯化分离纯化机械剪切法机械剪切法分离特定大小分离特定大小DNA片段片段酶法酶法部分酶切部分酶切分离特定大小分离特定大小DNA片段片段完全酶切完全酶切ln（1-P）ln（1-f）用不同生物的完全基因组构建的基因组文库用不同生物的完全基因组构建的基因组文库应具有的克隆数和实际克隆数应具有的克隆数和实际克隆数 3.供体与载体供体与载体DNA连接连接要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓浓度和两种度和两种DNA分子的克分子比率。分子的克分子比率。4.重组重组DNA分子的

3、转移和基因组文库的扩增分子的转移和基因组文库的扩增利用转化或感染方法将连接利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能分子被扩增（重组子比率可能发生变化）发生变化）5.基因组文库质量的评价基因组文库质量的评价1）文库规模）文库规模-随机挑取一些转化子或重组子，提取质随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。算文库大小。2）重组频率）重组频率-频率越高，质量越高，可大大减轻后续频率越高，质量越高，可大大减轻后续

4、筛选基因工作量。筛选基因工作量。三三.利用质粒载体利用质粒载体构建基因组文库构建基因组文库BamHIMboIOHPOHHO脱磷酸化重组DNAT4 连接酶转化E.coli基因组文库总DNAHindIIIBamHISalIEcoRIPstIScaITcAmpRRpBR322(4.36 kb)OriHindIIIEcoRIPstIScaIAmpROriSalI该法简单、快速、易于该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。等真核生物和原核生物。四四.利用利用载体构建基因组文库载体构建基因组文库1.载体载体DNA片段的制备方法片段的制备方法:左右臂左右臂DNA片段

5、的获得片段的获得2.供体供体DNA片段的制备片段的制备:限制酶部分酶切，机械剪切法限制酶部分酶切，机械剪切法3.重组重组DNA分子的形成：分子的形成：控制克分子比率，使其形成串状控制克分子比率，使其形成串状DNA分子分子4.重组重组DNA分子的包装分子的包装1）DNA的包装物的制备的包装物的制备使用的大肠杆菌菌株：使用的大肠杆菌菌株： E.coliBHB2688(N205recAimm434cItsb2redEamSam/)-包装蛋白包装蛋白 E.coliBHB2690(N205recAimm434cItsb2redDamSam/)-头部蛋白头部蛋白i.两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混

6、合两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合-本底低（对本底低（对DNA分子大小有严格限制），高效。分子大小有严格限制），高效。ii.两菌株分别培养，混合收集和制备两菌株分别培养，混合收集和制备-操作简单，操作简单，本底高，可包装不同大小的本底高，可包装不同大小的DNA分子。分子。2）重组重组DNA分子的包装过程分子的包装过程包装制备物（包装制备物（-70）于冰上缓慢融化）于冰上缓慢融化加入重组加入重组DNA分子分子边融化边混合边包装边融化边混合边包装离心除去离心除去细胞碎片细胞碎片颗粒于颗粒于-70保存待用保存待用5.基因组文库的扩增基因组文库的扩增包装的包装的颗粒颗粒感染感染E.coli培

7、养培养分离分离颗粒颗粒-70保存保存五五.利用利用COS质粒载体构建基因组文库质粒载体构建基因组文库构建过程与构建过程与载体构建过程相似载体构建过程相似:两臂两臂DNA片段的制备，片段的制备，供体供体DNA片段的制备，两片段的制备，两DNA的连接和重组的连接和重组DAN分子的包分子的包装。装。单单COS质粒载体质粒载体和和双双COS质粒载体质粒载体构建基因组文库。构建基因组文库。为提高文库质量，可采取以下措施：为提高文库质量，可采取以下措施：1.双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体2.供体供体DNA脱磷酸化以避免供体脱磷酸化以避免供体DNA间

8、的连接导致重排间的连接导致重排3.载体和供体载体和供体DNA末端修饰以避免上述两种情形发生末端修饰以避免上述两种情形发生载体载体DNAXhoIorSalI酶切酶切补补CT连接连接重组重组DNA供体供体DNASau3AI部分酶切部分酶切补补AG4.采用文库快速构建法以避免扩增文库时采用文库快速构建法以避免扩增文库时DNA丢失丢失AprOricosBHHind AprOricosBHCosHind AprOriBHAprOricosBHCosSal ISHHSCosSCosS1Bam H ISHHSCosSCosS1Bam H ICosS1Bam H IHCosS1Bam H ICosHCosCo

9、sHSSHSSH大片段小片段35-45kb DNA 片段T4 DNA ligaseCosHCosSoriAp r利用单利用单COS质粒载体文库质粒载体文库SS离体包装感染E.coli利用双利用双COS质粒载体质粒载体构建基因组文库构建基因组文库 七七.利用利用YAC载体构建基因组文库载体构建基因组文库1.两臂两臂DNA片段的制备片段的制备:pYAC4BamHI/EcoRI脱磷酸化脱磷酸化2.供体供体DNA片段的制备片段的制备:琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶-DNA样品的制备样品的制备EcoRI部分酶切部分酶切脉冲场脉冲场凝胶电泳凝胶电泳片段回收和纯化片段回收和纯化3.DNA的连接的连接4.重组重组DAN

10、分子的转化分子的转化:原生质体转化法原生质体转化法5.转化子的保存转化子的保存:单菌落保存于单菌落保存于96孔平板中孔平板中Sup4CEN4ARS1TRP1OripYAC4ESmSXBXB红色Ura+,Try+转化子菌落脉冲场凝胶电泳酵母人工染色体构建酵母人工染色体构建建立基因组文库的载体建立基因组文库的载体 A鸟枪法鸟枪法5 目的基因的克隆与基因文库的构建鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基随机克隆供体细胞的全

11、基因组因组DNA片段，然后通过快片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的中分离出含有目的基因的目的目的重组子重组子，进而获得目的基因。，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离因的克隆分离鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体染色体DNA的切断的切断超声波处理：超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切：全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但可能使基片段长度不均一，粘性末端便于连接，但可能使基因断开。因断开。部分酶切：部分酶切：片段长

12、度可控，含有粘性末端，目的基因完整片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整与载体连接与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体选择多拷贝克隆载体;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体则选择表达型载体l转化受体细胞转化受体细胞 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的

13、基因表用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞达的受体细胞l筛选含有目的基因的目的重组子筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）建立）鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中高

14、重组子中目的重组子目的重组子的出现频率的出现频率 使用特征性限制性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8kb的的SalI片段中，将染色体片段中，将染色体DNA用用SalI切开，琼脂糖凝胶切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0 kb大小区域内的凝胶大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收块，从此凝胶块中回收DNA片片段，然后与载体进行拼接段，然后与载体进行拼接在连接前将在连接前将DNA片段进行分级分离片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb

15、鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进冻融法冻融法滤纸法滤纸法吸附法吸附法低融点凝胶法低融点凝胶法溶解法溶解法凝胶凝胶DNA片段片段回收回收技术技术 鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的工作量较大，需要了解目的基因的背景知识背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内不能除去真核生物目的基因的内含子结构含子结构第二节第二节cDNA文库的建立文库的建立定义：定义：从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA经反转录成经反转录成cDNA后再重组和增殖所产生的无性后

16、再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。繁殖系的总和。一一cDNA文库的特点文库的特点1.基因特异性基因特异性常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：15%mRNA，8085%rRNA，1015%tRNA2.器官特异性器官特异性不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所所组建的组建的cDNA文库也就不同文库也就不同4

17、.不均匀性不均匀性在同一个在同一个cDNA文库中，不同类型的文库中，不同类型的cDNA分子的数分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。克隆数相较，这是两种文库的另一差别。5.各各cDNA均可获得表达（一般选用的载体都是表达均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）型的）3.代谢或发育特异性代谢或发育特异性处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同亦不相同二

18、二.cDNA文库的规模文库的规模N=f为某一特定为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部）的分子数目与全部cDNA（mRNA）分子数目之比）分子数目之比三三.建立建立cDNA文库的一般程序文库的一般程序1.载体载体DNA片段的制备片段的制备2.多聚（多聚（A）RNA的分离与纯化的分离与纯化3.双链双链cDNA的合成的合成1）单链）单链cDNA的合成：反转录法的合成：反转录法2）第二条）第二条cDNA的合成：碱解或酶解（的合成：碱解或酶解（RNaseH）法除）法除去去RNA分子分子ln(1p)ln(1f)RNaseHDNAdNTP聚 合 酶DNAligase RNaseHRNaseH酶解取

19、代法酶解取代法cDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略mRNAc cDNA第一链的合成第一链的合成 5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH3TTTTTTTTTTTTTTp55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一链第一链引物引物退火退火逆转录酶逆转录酶dNTPsc cDNA第二链的合成第二链的合成 煮沸煮沸NaOH自身引导法：自身引导法：获得的双链获得的双链cDNA5端会有几对碱基缺失端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp5TTTTTTTTTTTTTTp5AAAAAAAAAAAAAAOH3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1c cDNA第二链的合成第二链的合成 DNApoldNTPsRNaesH置换合成法：置换合成法：获得的双链获得的双链cDNA5端也会有几对碱基缺失端也会有几对碱基缺失5pp