STR 微卫星SSRPPT课件

1、Contents何为STR1STR的特点2STR的应用3STR分子标记技术4 展 望5第1页/共38页第2页/共38页1.1 STR的发现 真核生物基因组中广泛存在着串联重复序列。根据重复单位大小的不同，Tautz(1993)将重复序列分为3类：卫星序列、小卫星序列和微卫星序列。卫星序列通常存在于异染色质，主要分布在着丝粒区域。其重复单位达上千个碱基，重复程度可达到103107次(Debrauwere et a1，1997)。与卫星序列相比，小卫星序列和微卫星序列的重复单位要短，重复程度也小。对于小卫星序列和微卫星序列的区分，并没有特别明确的界限。通常将重复单位超过10或l5 bp、位点长度约

2、在05100 kb的称为小卫星序列；而那些重复单位只有15 bp，长度仅为几百bp的位点称为微卫星序列。二者之间还有一些过渡类型.第3页/共38页 20世纪80年代后期,Marshfield医学研究基金会的James和俄勒冈健康科学大学的Wis等人分离出来一种比小卫星DNA具有更短重复单元的卫星DNA，被称为微卫星DNA（micro satellite DNA），又被 称 作 短 串 连 重 复 ( S h o r t Ta n d e m Repeats, STRs)或简单重复序(Simple Sequence Repeat, SSRs), 每单元长度在16bp之间，广泛分布于基因组中，其中

3、富含A-T碱基对。根据重复单元的构成与分布,微卫星序列被分为3种类型： 单一型:ATATATATATATATATATATATAT 复合型: ATATATCACACACACACACAC 间 断 型 : ATATAT C A ATATAT C A ATATATA第4页/共38页1.2 微卫星DNA的构成第5页/共38页1.3 STR的分布 在基因组中平均50kb就有一个重复序列。据GeneBank等数据库资料统计人类23对染色体上至少分布着7 901个STR位点,每对染色体的STR位点分别超过100个,其中1、2号染色体的位点均超过600个,性染色体上的已知位点数在264个以上,随着人们对STR的

4、进一步研究,其数目还会不断增加。第6页/共38页1.4 STR突变的可能机制 目前认为滑链错配是短串联重复序列突变的主要机制。 在DNA复制合成的过程中，新生链和模板链之间在微卫星重复区域可能发生错配，使得一个或者几个重复单位形成环状，未能参与配对。如果未配对的重复单位位于新生链，则最终得到的新生链未配对重复单位数目比模板链多。反之，如果未配对的重复单位位于模板链，则最终得到的新生链未配对重复单位数目比模板链少。第7页/共38页第8页/共38页2.STR的特点 种类多、分布广，并按孟德尔共显性方式在人群中世代相传。在基因组中平均50kb就有一个重复序列，突变率低（ 0.04%）。 在人群中高度

5、多态，其多态信息含量容量超过70%。其多态性表现为正常人群的不同个体某一基因位点重复序列的重复次数可不一样，同一个体的两个同源染色体上重复次数也可以不一样，即微卫星DNA拷贝数在人群中是可变的。 具有遗传连锁不平衡现象。 第9页/共38页均可被转录，有些编码蛋白质，而另一些则位于非转译区的5端和3端不编码蛋白质。属于不稳定的DNA序列，其数目在某些遗传病中有扩大现象，而这种扩增并非是减数分裂的重组造成，扩大可发生在减数分裂过程中，由一代传递给另一代，也可发生在有丝分裂中，导致嵌合体形成。与成熟人体细胞比较，微卫星DNA在胚胎时期有丝分裂很不稳定。在不同基因位点上的微卫星DNA的重复序列可以不同

6、，也可以相同。第10页/共38页嵌合体形成的机理示意图有丝分裂不分离（A，B）及染色体的丢失（C）第11页/共38页3.STR的应用 微卫星DNA 作为遗传标记具有很大的优越性。近年来随着研究的不断深入,对微卫星标记的研究不仅具有重要的理论意义, 而且还具有较好的应用前景。第12页/共38页3.1 STRSTR用于基因定位及构建遗传连锁图谱 由于微卫星重复单位数量多，重复单位片段短，且重复程度不一样，同一类微卫星可分布在整个基因组的不同位置上，可将随机PCRPCR标记沿着染色体锚定在已知位置，因而可以用作功能基因定位。由于微卫星标记来源于基因本身的序列，因而通过对微卫星标记的定位，也就相应地定

7、位了其来源基因。 遗传连锁图谱是利用遗传标记进行连锁分析来反应遗传标记之间的相对关系。现在使用最广泛的是微卫星标记。第13页/共38页第14页/共38页3.2 STR用于个体识别和亲权鉴定 因为STRSTR广泛存在于基因组中, ,具有高度多态性、杂合性和稳定性。当把几个STRSTR位点联合分析后, ,可以得到相当高的累积个体识别率和父权排除率。 第15页/共38页3.3 STR用于遗传学多态性研究 STR标记多位于非编码区,变异一般不影响人体的结构与功能,突变在进化过程中受自然选择压力较小,以近乎稳定的速率传递且不断积累,形成多样性。 通过研究STR多态性,变异速率以及比较序列间差异、人群间差

8、异,分析不同人群间的遗传距离,就可从分子生物学角度揭示人类的起源、迁徙、进化等历史进程。 第16页/共38页 目前,根据STR标记、Y染色体DNA等的研究,大多数分子遗传学家支持现代人类单起源学说,认为现代人类起源于20万年前的非洲原始部落,然后向世界各地迁徙。但也有学者支持现代人类多起源,认为除非洲外,亚洲、欧洲也可能是人类发源地。第17页/共38页第18页/共38页3.4 STR用于种质鉴定和品种分类 由于微卫星座位的复等位性，使它易于鉴别同一物种的不同基因型。Guilford等利用（GA）15（GT）15作为探针筛选苹果基因组文库，证明了这些重复序列的多态性，并且利用3个微卫星标记就能足

9、以区分21个苹果品种。Akagi等利用高度多变的含（AT）n的17个微卫星标记，成功地区分了59个亲缘关系极近的粳稻品种。第19页/共38页3.5 STR在疾病诊断和治疗中的应用第20页/共38页 国外学者曾在科学杂志发表论文显示，用微卫星分析方法，可以直接从病人尿液中的脱落细胞检出早期癌变细胞，准确率达95%。程书钧院士他们采用美国报道的13个微卫星位点对36例中国人膀胱癌进行分析，发现微卫星异常检出率只有文献报道的一半，即意识到这可能是由于东西方人种之间的差异(或病因学上的不同)所致，因此不再照搬西方人的研究结果。 自己着手研究并得出结论:作为一种无创伤性手段，尿沉渣DNA微卫星分析对于膀

10、胱癌的筛查和早期诊断具有一定意义；与美国报道的诊断组合的不同，反映了人种差异和可能的病因学差异。第21页/共38页4. STR分子标记技术（举例） STR标记技术是一种通过直接分析遗传物质的多态性来鉴别生物内在核苷酸排布及其外在性状表现规律的技术。第22页/共38页4.1 原理与方法 根据微卫星DNA两端序列的保守性，设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，以检测、分析微卫星序列多态性；并确定基因排布序列及表型，最终达到成功鉴定种子纯度的目的。 简而言之，就是通过对样本DNA多态性的分析，从而来得到样本DNA序列以及在遗传性状上的调控和差异。第23页/共38页第24页

11、/共38页实验仪器第25页/共38页植株材料植株材料研磨研磨细胞裂解细胞裂解裂解液裂解液上层溶液上层溶液抽提抽提异丙醇沉淀异丙醇沉淀离心洗涤离心洗涤干燥溶解干燥溶解DNADNA溶液溶液第26页/共38页PCR SSR引物设计 根据CMD(Cotton Marker Database)已公布的序列来设计相对SSR引物。第27页/共38页第28页/共38页 荧光PCR第29页/共38页第30页/共38页第31页/共38页结果分析A.利用荧光信号随着PCRPCR反应的积累来实时监控PCRPCR反应的进程，并通过分析软件对PCRPCR的反应进行检测分析。B.分析结果第32页/共38页4.2 STR标记的主要特点 （1）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子； （2）具有较多的等位性变异； （3）实验重复性好，结果可靠； （4）周期短，包括发芽时间，一般收到样品后8天左右可得结果； 第33页/共38页 （5）无论叶片还是茎杆均可用于检验； （6）技术难度低，一般技术人员经培训就可上岗操作； （7）引物开发比较困难，成本较高。第34页/共38页5. 展望 微卫星DNA的研究近年来已取得了明显进展,但微卫星DNA标记还存在很多问题，