细胞培养入门技术PPT学习教案

1、会计学1第1页/共46页离心机橱柜实验台冰箱培养箱试剂柜实验仪器台超净工作台实验台实验台实验台实验台水池冰箱衣柜实验台显微镜递物窗缓冲间无菌操作室准备室1.细胞培养室设置第2页/共46页下风下风口口上风口上风口无菌操作室第3页/共46页超净工作台和CO2培养箱2.2.细胞培养的主要实验设备细胞培养的主要实验设备n超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱

2、内空气干净。定期消毒箱内蒸馏水槽中预留灭菌蒸馏水，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。第4页/共46页解剖显微镜倒置显微镜2.2.细胞培养的主要实验设细胞培养的主要实验设备备第5页/共46页血清（天然成分）：基础培养基（人工合成）：干粉培养基DMEM 、-MEM、RPMI1640水：高纯度的去离子水细胞培养的主要试剂（培养基）抗菌素：通常是青霉素和链霉素联合使用，使用浓度为100U/mln 血清质量好坏是实验成败的关键。n 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。n 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体病毒污染。n 血清的灭活（消除补体

3、活性）：56 ，30 分钟n 血清的消毒：过滤除菌n 血清的使用浓度为520消化液：常用0.25胰蛋白酶，使细胞脱离组织或容器壁， 用含血清培养液中止其活性第6页/共46页细胞培养用器皿的清洗和消毒 一般玻璃器皿的清洗分为四个步骤：1、自来水浸泡2、洗涤剂刷洗(如有必要进行超声处理）3、泡酸（浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水）4、流水冲洗过夜，依次用蒸馏水、三蒸水漂洗，最后烘干备用 常用消毒方法：1、湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌），15磅，1520min2、过滤除菌(如：血清的除菌）第7页/共46页 细胞培养(cell culture)是指细胞的离体培养，是在无菌条件下，把动物或植物的细胞从机体中分离出来

4、，置于培养皿中，并在一个合适的环境中，给以营养物质，使之继续生存和繁殖的方法。第8页/共46页 原代培养(primary culture)，或称为初代培养，就是从供体取下组织细胞后在体外进行的首次培养，中途不分割培养物。常用的原代培养方法有组织块培养法和消化培养法。第9页/共46页 传代培养(secondly culture)，在原代培养物铺展为单细胞层后，将原代培养细胞分开接种到两个或多个新的培养瓶中继续培养增殖。第10页/共46页第11页/共46页v 贴附型 成纤维样细胞型 上皮样细胞型v 悬浮型培养人真皮成纤维细胞培养人口腔上皮细胞培养的骨髓瘤细胞第12页/共46页v 细胞的贴壁生长v

5、接触抑制v 细胞的生长曲线细胞贴壁延展过程细胞贴壁延展过程( (模式图模式图) )细胞的接触抑制现象细胞的接触抑制现象第13页/共46页正常培养细胞的生长曲线正常培养细胞的生长曲线退化死亡平台期细胞数增大极限点，出现接触抑制细胞指数生长极限点指数生长期潜伏期细胞数量024487296120小时指数生长期是最佳实验期指数生长期是最佳实验期 ! !第14页/共46页第15页/共46页第16页/共46页第17页/共46页第18页/共46页第19页/共46页第20页/共46页第21页/共46页第22页/共46页第23页/共46页第24页/共46页第25页/共46页第26页/共46页v 将原代培养物分割

6、后重新接种到两个或多个培养瓶内进行培养，这一操作称为传代培养,传代比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异.v 细胞传代培养的意义v 传代时机的把握v 传代培养的代数限制；少数细胞可出现永生化第27页/共46页吸去旧液加入消化液解离细胞约2min在倒置显微镜下观察，细胞呈圆粒状细胞的传代培养细胞的传代培养：贴附型贴附型PBS洗 涤12次吹打悬浮细胞调整细胞密度 分装接种，置于CO2培养箱中继续培养在培养瓶中加入适量含血清培养液培养细胞的观察第28页/共46页细胞的传代培养细胞的传代培养：贴附型贴附型培养细胞的观察培养液颜色、是否清亮培养液颜色、是否清亮培养细胞的状态培养细胞的状态第29页/共46

7、页细胞的传代培养细胞的传代培养：贴附型贴附型吸去旧液加入消化液解离细胞约5min在倒置显微镜下观察，细胞呈圆粒状PBS洗 涤12次吹打悬浮细胞调整细胞密度 分装接种，置于CO2培养箱中继续培养在培养瓶中加入适量含血清培养液培养细胞的观察胰酶消化数分钟胰酶消化数分钟细胞脱离器壁，呈圆粒状细胞脱离器壁，呈圆粒状第30页/共46页吸去旧液加入消化液解离细胞约2min在倒置显微镜下观察，细胞呈圆粒状细胞的传代培养细胞的传代培养：贴附型贴附型PBS洗 涤12次吹打悬浮细胞调整细胞密度 分装接种，置于CO2培养箱中继续培养在培养瓶中加入适量含血清培养液培养细胞的观察中止消化、吹散细胞中止消化、吹散细胞细胞计数，调节密度细胞计数，调节密度第31页/共46页细胞的传代培养细胞的传代培养：悬浮型悬浮型直立瓶去旧液加新液分瓶接种加新液第32页/共46页第33