噬菌体裂解液的制备和菌种的保藏、噬菌体效价的测定、细菌转导测定、凝聚反应、沉淀反应解析

1、微生物学实验实验名称 噬菌体裂解液的制备和菌种保藏噬菌体效价的测定、细菌转导的测定凝聚反应、沉淀反应姓名学号系别班级实验日期 同组姓名实验原理及摘要1、噬菌体效价的测定溶原性细菌经紫外线照射诱导后，使原噬菌体从细菌染色体上脫离而进入裂解周期，在宿主 菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。细菌被裂解，释放出游离的噬菌体 粒子，通过离心，获得噬菌体裂解液。噬菌体的效价是指ImL噬菌体裂解液中所含噬菌体 的数量在含有敏感宿主菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，根据噬菌斑形成单 位（plague-for ming units, pfu）进行噬菌体效价的测定,一般用双层琼脂平板法测定

2、。2、细菌转导的测定转导可以分为两种类型，即普遍性转导和局限性转导。本实验为局限性转导，以双重溶原性 细菌E.coliK12F（k）gal-7j供体，经紫外线（UV）诱导，在噬菌体裂解液中将含有两种类型 的噬菌体（X和Xdg）o Xdg是缺陷噬菌体，英基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因（gal）, 当缺陷型噬菌体Xdg再次侵染敏感菌大肠杆菌K12 S时，会将发酵半乳糖的基因转移到S 菌，使S菌获得基因gal,从而使S菌获得发酵半乳糖的能力。利用转导子在EMB培养基 上发酵半乳糖的特征进行转导频率的计算和分析。3、凝聚反应凝集反应是指颗粒型抗原与相应抗体混合时，在电解质的影响下，形成肉眼可见的

3、凝集块。 电解质的作用主要是消除抗原-抗体复合物表而的电荷，使其失去同种电荷相斥的作用，抗 原-抗体复合物失稳而相互凝聚。温度升高加速分子运动使凝集反应速度加快，一般反应在 37°C或56°C水浴中进行。发生明显凝集反应（反应强度为+）的最高稀释度的倒数值为该 免疫血淸的效价。凝集反应试验可分为玻片凝集试验和试管凝集试验。前者的优点是简便快 速，是鉴左传染病标本细菌的重要手段。后者是一种定量方法，可利用已知抗原鉴左相应抗 体的效价。4、沉淀反应沉淀反应与凝集反应的基本原理相同。不同的是沉淀反应所采用的抗原是可溶性的，如血淸、 细菌渗岀物等。由于抗原是可溶的，抗原与抗体反应的

4、结果时形成很细微的沉淀。沉淀反应 可以在液体中进行，也可以在凝胶中进行。以液体形式在试管中进行时，抗原与抗体在交界 而处形成环状的乳白色沉淀物，故称环状沉淀反应。双向琼脂扩散法是将抗原和抗体分别加 入琼脂凝胶版小孔中，两者互向对方扩散，相遇后若特异性结合且比例适当，形成乳白色沉 淀线。实验目的1、了解温和噬菌体与宿主菌之间的溶原关系。2、学习利用溶原性细菌制备噬菌体裂解液的方法。3、了解菌种保藏的基本原理和方法。4、学习微生物大小的测疑。5、学习噬菌体效价测泄的方法6、了解转导原理、学习转导实验方法7、学习凝集反应和沉淀反应的实验方法8、了解血淸学反应在实际中的应用9、了解凝集反应的基本原理实

5、验材料菌种：大肠杆菌E.coli K12 F gal+ （双重溶源菌，含有入噬菌体和缺陷型噬菌体Xdg的基因 组，发酵半乳糖）；大肠杆菌EcoK12Sgal-（非溶源菌，对噬菌体敏感，不发酵半乳糖） 培养基：牛肉膏蛋白丿冻固体及液体培养基、加倍肉汤培养基、半固体素琼脂、磷酸盐缓冲液 （0.1mol/L.pH7.0）,无菌水、氯仿、EMB培养基仪器及用具；试管、三角瓶、离心机、离心管、振荡器、培养皿、紫外灯（UV灯，30W）、 磁力搅拌器、涂布器、酒精灯、恒温水浴箱、培养箱等其他材料：E. coli及其抗血清人IgG及兔抗人IgG载玻片、1 %琼脂糖、打孔器等实验内容及步骤一、噬菌体裂解液的制备

6、和菌种保藏K菌种活化K12F37 C1824 hr37 C 46 hr3000 rpm10 min牛液弃上淸，用等体积PB （2mL）悬浮细胞，制成菌悬液2、UV诱导及增殖培养UVImin UV13Sec （开盖）避光培养37°C,2 h/"、2mL菌悬液磁力搅拌2mL加倍肉汤离心管加0.2mL氯仿，震荡30S,静置5分钟：离心（3000rpm. lOmin）,收集上淸（噬菌体裂解液）。3、菌种保藏原则：干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养、添加保护剂等。二、噬菌体效价的测定、细菌转导的测定1、噬菌体效价的测定1）受体菌（E. coli kl2S gal ）活化2）噬菌体裂解液

7、的制备取0.5mL前述制备的噬菌体裂解液，用每管4.5mL牛液将噬菌体裂解液稀释到3）倒平板牛肉膏蛋白腺培养基：5个平版EMB培养基：5个平板4）将素琼脂溶化，保温于50C,向每支素琼脂中接入0.5mL K12 S gal'，混匀，再分別取 噬菌体裂解液0.5mL （10-3、10-4）,加入到素琼脂中，摇匀后立刻倒在牛肉膏蛋白腺 平板上。5）培养待平板凝固后于37 °C,培养1216h：根据噬菌斑数量讣算噬菌体效价。噬菌体效价/菌体数-mL-1 =每平肌平均噬菌体数x稀释倍数20.5mL（因所测噬菌体裂解液中入dg不能形成噬菌斑，且其数量与入数相等，故讣算时乘2.）2、细菌

8、转导的测定（1）点滴法1. 倒EMB平板 取已灭菌的EMB培养基熔化并冷却至不 烫手（约50°C）,然后倒平板，冷却后翻转平板，温箱放置 使表而干燥。2. 按右图所示在皿底用记号笔画好标记。3. 接种 无菌操作，取矢量培养活化的K12 S gal菌一环， 涂于S标记处：取适量活化的K12Fgal+菌液，划线接种于F 标记处；取适量噬菌体裂解液，涂于入标记处。4. 将接好的平板静置，所有菌液被培养皿吸收后再倒置，放 37°C培养4872h,观察结果。（2）转导频率的测定1. 取 0.5mLE.coli K12S37C 预热 10 分钟2. 取05mL裂解液,37C预热10分钟

9、3. 把上述S菌和裂解液混合均匀，37C预热10分钟4.用牛液把混合液稀释至1（P及105.取10心及10*稀释度0.2mL涂布EMB平板，于37C培养至少48h匚观察结果3、凝集反应按图加抗原和抗体及对照，静宜5“0mim先用肉眼观察，后用显微镜在低倍镜下观察。生理盐水 E. coli抗血淸4、沉淀反应将琼脂糖凝胶融化后滴加到T净的载玻片上，凝固后按下图位巻打孔并在孔中滴加相应的抗原和抗体。AntigenAntibody将载玻片放到一个培养皿中，并放入一个湿棉球: 将培养皿置于37 C培养12-24ho实验结果一.噬菌体效价的测定图1：含噬菌斑的平板，稀释浓度为107噬菌斑为透明的小斑点，对

10、光观察较为明显，图中黑点为人为观察记录时的标记。 噬菌斑数：左边16个，右边13个。噬菌体效价/菌体数mL7 =X 2 = 5800菌体数mL7(16 + 13)/2 X 10000.5mL图厶含噬菌斑的平板，稀释度为IO"噬菌斑数：左边39个，右边46个。噬菌体效价/菌体数 mLi = 土J'；X 2 = 17000菌体数 mL7二、细菌转导的测定(1)点滴法三角形区域没有明显现象：涂布F菌的长方形中长满了紫色带金属光泽的菌落：在阳光下， 涂布F菌的长方形区域与涂布噬菌体的圆形区域的重合处偶见深紫色带有金属光泽的菌落。（2）转导频率的测怎三、凝聚反应右侧为对照组，滴加磷酸盐

11、缓冲液（代替生理盐水）与E. coli ,无明显反应。左侧为实验组，滴加抗血淸与E. coli ,在室温下静置数分钟后形成肉眼可见的凝集块。 四、沉淀反应两个载玻片菌没有观察到明显现象，没有白色沉淀线生成。注：理想条件下，应出现如下图所示现象。 RI性反应在抗原和抗体之间形成白色沉淀线。沉淀反应：人IgG兔抗人IgG (左：中心为抗原，右：中心为抗体)分析与讨论一、噬菌体效价的测定溶原性细菌经紫外线照射诱导后，使原噬菌体从细菌染色体上脫离而进入裂解周期，在宿主 菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。细菌被裂解，释放出游离的噬菌体 粒子，通过离心，获得噬菌体裂解液。将经过适当稀释的噬

12、菌体裂解液与大量敏感菌混合后 倒入固体培养基平板的上层，每个噬菌体侵染一个宿主菌后在英中进行复制并最终导致该细 菌的裂解。释放岀的噬菌体继续侵染周围的细菌，最终形成一个肉眼可见的透明斑，即噬 菌斑，每个平板内噬菌斑的数量控制在100-300个为宜。由于E.cp/zK 12F是双重溶源菌， 植被的噬菌体裂解液中含有X和Adg两种噬菌体。只有入能形成噬菌斑。从实验结果易得：由IO", 10-3两个稀释度的噬菌体悬液所获得的噬菌斑算出的噬菌体效 价存在显著差异。可能原因：10倍系列稀释操作不当造成所获得的裂解液的噬菌体浓度 不成10倍关系：接种噬菌体前未将稀释好的噬菌体悬液摇匀，导致所取悬

13、液的噬菌体浓 度并非想要的浓度。二、细菌转导的测定(1) 点滴法该实验为定性实验。在点滴法转导实验中，F菌标记处是阳性对照，长岀的菌落为紫色带金 属光泽的菌落。入标记处是空白对照，只有噬菌体，没有受体菌，不能长岀菌落。S菌标记 处是阴性对照，由于S菌不能发酵半乳糖，形成的菌落是浅红色的菌落。任裂解液与S菌 的交叉处可岀现紫色带金属光泽的菌落。注：色泽可能由于主观原因得到不同的形容。®Xdg是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因(gal)。(2) 转导频率的测定在转导频率测左实验中，发生转导的菌落为紫色带金属光泽的菌落，大部分没有发生转导的 菌落为浅红色菌落。转导频率一般

14、较低，主要原因是：受体菌的生理状态：噬菌体悬液中只 有一半(hdg)可以引起转导，入dg能否进入受体菌细胞；Adg进入细胞后能否发生基因 重组等。在光下观察，4个培养皿中均未发现深紫色带有金属光泽的菌落存在，实验较为失败。失败 的可能原因：稀释后的裂解液太稀，噬菌体含量太少，而且本身细菌转导频率较低，综合 之下转导失败：对菌体色泽的判断因人而异，没有客观标准。三、凝集反应在凝集反应中，能较明显地观察到抗血淸端形成的凝集颗粒，而加磷酸盐缓冲液的一端则无 明显现象，这证明了在电解质的影响下，抗原与相应抗体混合可以形成肉眼可见的凝集块。四、沉淀反应在沉淀反应中，我组为观察到明显现象，他组偶见沉淀线，借此可以排除抗原或抗体变性或 不能特异性结合的可能。由教材克制，双向琼脂扩散法是将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶版 小孔中，两者互向对方扩散，相遇后若特异性结合且比例适当，形成乳白色沉淀线。因此我 组不能得到沉淀线的可能原因为：抗原与抗体的比例不合适；素琼脂层太薄，孔洞太注 不能盛装足够的抗原与抗体，导致二者不能扩散直至相遇形成沉淀。注意事项1. 素琼脂一定要保持在50C水浴中，防止凝固2. 转导频率测左时一定要稀释到合适浓度后才能涂平板，保证培养