色谱纯度HPLC分析方法验证报告样式

1、XXX色谱纯度分析方法验证报告目录XXX色谱纯度分析方法验证报告批准 31. 验证目的 42. 色谱纯度分析方法 42.1 仪器42.2试剂42.3标准品42.4色谱条件42.5溶液配制52.6进样操作53. 方法验证63.1 专属性63.2系统适用性试验 93.3精密度93.4线性及范围113.5准确度173.6 检测限及定量限 204. 验证评价及结论 215. 附件21XXX色谱纯度分析方法验证报告批准对本验证方案批准表示同意其 验证项目和可接受标准、验证方法和本方案内的各种表格格式、 内 容。在执行本方案的过程中可能会遇到阻碍本方案精确地完成的缺陷。较小的偏差可以在偏差报告内陈述。较大

2、的偏差，如，方法的修改，测试 /评估参数，接受标准等只有在附带有经过批准的补充 材料的情况下才予以承认。所有经批准的偏差报告和补充材料都应附在批准前的验证报告内。方案起草签名日期质检中心方案审核签名日期质检中心QC总工程师质量部QA方案批准签名日期质量副总1 .摘要我们按照USP3 0专论的方法测定XXX的色谱纯度。方法的原理是采用 HPL5法，在233nm检测波长下测定，以xxx为参考标准，进行色谱纯度的定量分析。该方法用于xxx原料药在放行及稳定性试验中色谱纯度的测定。经评价，实验室色谱纯度的条件，包括色谱柱、流动相、检测波长、进样量、浓度等条件完全与USP专论规定的一致。 杂质A, C,

3、 D ,以及杂质XA、杂质XB和杂质XC是X X X实际存在和潜在的杂 质。为了评价实验室的仪器、人员、环境等能否满足色谱纯度测定的要求，按照 ICH指南Q2A和Q2B 的要求，对分析方法进行了验证，验证的项目包括专属性、系统适用性试验、精密度、线性、范围、准 确度、定量限和检测限，验证结果表明，每个验证项目均符合验证标准。USP色谱纯度的分析方法适合于X X X原料药中杂质的测定和控制。验证结果摘要如下：a. 专属性：溶剂对杂质的测定没有干扰，xxx与相邻杂质 XA和杂质D的分离度依次为21.1 和13.2,较相邻的杂质D和杂质A的分离度为1.8,杂质XB和XC的分离度为1.6,均大于1.5

4、, 表明X X X与每个杂质以及每个杂质之间分离度均符合要求。b. 系统适用性试验：在系统适用性溶液的色谱图中，3-苯甲酰基苯甲酸和XXX的分离度R为13.3,大于4;以计算色谱柱的理论塔板数N为20328,大于2250;。刘条的拖尾因子T为0.83，小于2.0;标准溶液连续进样 6次，其主峰面积的 RSD为0.51%,小于5%。c. 精密度：标准溶液重复进样 6次，在重复性项下，杂质 C,杂质XA, XXX ,杂质D,杂质A, 杂质 XB 和杂质 XC峰面积的 RSD依次为 0.24%, 0.41%, 0.51%, 0.54%, 0.21%, 1.6%和 0.86%, 均小于5%;在中间精密

5、度项下测得的 RSD依次为0.20%, 0.23%, 0.60%, 0.60%, 0.24%, 1.1% 和0.49%,均小于5%; F-test结果表明，每个组分的 F值均小于F。值5.05,表明方法的中间精 密度和重复性之间的精密度无显著性差异。d. 线性和范围：杂质 A的含量在0.02%0.24%的范围时，它的线性方程为 Y=153.713X-0.214 , 相关系数为0.99996 ;杂质C的含量在0.02%0.24%的范围时，它的线性方程为 Y=62.854X-0.236，相关系数为0.9999;杂质D的含量在0.02%0.24%的范围时，它的线性方 程为Y=27.520X-0.42

6、3，相关系数为 0.9999;杂质XA的含量在0.02%0.24%的范围时，它的 线性方程为Y=86.007X-0.725 ,相关系数为0.9999;杂质XB的含量在0.02%0.24%的范围时， 它的线性方程为 Y=13.160X-0.325，相关系数为0.9997;杂质XC的含量在0.02%0.25%的范 围时，它的线性方程为 Y=65.240X-1.546，相关系数为0.9998;代表其它杂质的XXX含量在0.02%0.25%的范围时，它的线性方程为 Y=33.579X-0.558，相关系数为0.9998;每个杂质 的相关系数均大于0.999,表明它们的峰面积与浓度均呈线性关系。e.准确

7、度：杂质A、杂质C、杂质D、杂质XA、杂质XB、杂质XC和XXX的回收率依次为 99.4%,99.2%, 98.5%, 99.0%, 98.7%, 98.5% 和 100.5%，回收率的 RSD依次为 1.2%, 1.8%, 1.4%, 1.8%, 2.9%, 2.5%和2.4%;每个杂质的回收率均介于95.0%105.0%之间。f.定量限和检测限：杂质 A、杂质C、杂质D、杂质XA、杂质XB、杂质XC和XXX的检测限依次为 0.0002%, 0.0002%, 0.002%, 0.0004%, 0.005%, 0.001%,它们的定量限依次为 0.001%, 0.001%, X %, 0.00

8、2%, 0.02%, 0.005%，结果表明，方法的灵敏度适合杂质的检测和控制。2. 分析方法XXX USP30专论2.1仪器：高效液相色谱仪Agilent 1100 HPLC2.2试剂：a. 乙睛（色谱纯）b. 磷酸二氢钾（分析纯）c. 纯化水2.3标准品：a. R标准品b. 3-苯甲酰基苯甲酸2.4色谱条件：a）色谱柱：YMC Pack ODS-A , 4.6mmX 150mm , 3"；b）pH3.5缓冲液：称取68.0g磷酸二氢钾，用水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调pH值为3.50土 0.05,过滤。c）流动相：水-乙睛-pH3.5缓冲液=550:430:20配制方法：用

9、适宜的量筒分别量取过滤的水550ml，乙睛430ml和pH3.5缓冲液20ml,于一合适的试剂瓶中，充分混匀。在超声波上脱气10分钟。也可按照待测样品的数量，按照比例配制适量的流动相。d）检测波长：233nm；e）流速：1.0ml/min ;f）进样量：20 pl。2.5溶液制备a）系统适用性溶液：量取0.5ml标准贮备溶液和 3-苯甲酰基苯甲酸贮备溶液1.0ml至10ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度， 混合均匀。XXX和3-苯甲酰基苯甲酸的浓度依次约为0.01mg/ml和 0.005mg/ml。3-苯甲酰基苯甲酸贮备溶液：称取3-苯甲酰基苯甲酸标准品 5.0mg,置100ml容量瓶中，加流动

10、相溶解并稀释至刻度，混合均匀。b) 标准溶液：标准贮备溶液：称取准品约10.0mg,置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，混合均匀。精密量取1.0ml至100ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，混合均匀。浓度约为0.002mg/ml。c) 供试溶液：称取xx>4羊品约100mg,精密称定，置 100ml棕色容量瓶中，加适量流动相，用超声波使溶解，放冷至室温，用流动相稀释至刻度，混合均匀。该溶液制备应避光操作。2.6进样操作2.6.1仪器准备按照高效液相色谱仪操作规程准备仪器，设定流速为1.0ml/min，设定检测器波长为 233nm。待仪器平衡后，开始进样操作。2.6.2系统适用性

11、试验：系统平衡后，取系统适用性溶液进样，记录色谱图，3-苯甲酰基苯甲酸和x x x的相对保留时间依次为0.8和1.0; 3-苯甲酰基苯甲酸和X X X的分离度 R至少为4。以X X X峰计算色谱柱的理论塔板数N,应不少于2250; XXX峰的拖尾因子 T,不大于2.0。标准溶液连续进样 6次，记录色谱图，其主峰面积的RSD< 5%。2.6.3空白测试：取流动相进样，记录色谱图。在样品的测试中忽略溶剂峰。2.6.4样品测定7倍，以峰面积计算杂质的含量。(2)计算XX冲总杂质的含量。公式(1)公式(2)取供试品溶液进样，记录色谱图至主峰保留时间的2.6.5计算公式：按公式(1)计算>O

12、<X中单个杂质含量；按公式单个杂质含量(%) = 5叩勺00%Wi As 50Ws ' Ai P 100%总杂质含重 (%)=Wi As 50式中：WHXXX标准品的重量，mg；Wixxx的样品的重量，mgAi 样品色谱图中单个杂质的峰面积；Asr标准溶液中主峰的峰面积。Prxx x US雨准品的含量Z Air样品色谱图中总杂质的峰面积，等于 £ Ai= A总面积一A”*。2.6.6结果判定：供试品中单个杂质不大于0.2%，总杂质不大于1.0%。3. 方法验证 3.1专属性3.1.1空白测试：取溶剂流动相进样，记录色谱图，做为空白，确定溶剂对杂质测定有无干扰，在样品测定

13、图谱中溶剂峰应忽略。色谱图见KP0-BLANK000000.D3.1.2单个杂质的定性3.1.2.1杂质定性溶液：依次取“ 3.4.1.1杂质标准贮备液”项下杂质A、杂质C、杂质D和杂质XA、杂质XB、杂质XC的标准贮备溶液2.0ml，各至一个25ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，混合均匀。3.1.2.2取每个杂质溶液分别进样，记录色谱图。记录每个杂质的保留时间，用保留时间对每个杂质进行定性，结果填写在表 1-1。按照保留时间顺序，杂质 C, XA, D, A, XB, XC的保留时间依次为2.218min, 5.168min, 11.402min,12.019min, 17.191min,

14、17.960min 。它 们的色 谱图见 KP0-000001.D , KP0-000003.D , KP0-000005.D , KP0-000006.D , KP0-000008.D , KP0-000009.D 。表1-1 各杂质的定性杂质名称浓度(Mml )保留时间（min）杂质C8.02.218杂质D8.211.402杂质A8.012.0193.1.3杂质和xxx的分离度测试以重复性项下的色谱图进行评价，记录各组分的出峰顺序和保留时间，并计算相邻组分之间的分离度R,数据见表1-2。色谱图见 KP0-000014.D。3.1.4 X X X加入已知杂质的分离度测试3.1.4.1溶液制备

15、称取XXX样品 10mg,加入线性项下标准贮备溶液（10M,ml） 2.0ml,再加入流动相溶解并稀释至10ml,混合均匀。3.1.4.2 测定：取该溶液进样，记录色谱图，记录各组分的出峰顺序和保留时间，计算它们的相对保留时间（RRT）（XXX为1.0 ）和相邻组分之间的分离度R,数据见表1-3。色谱图见KP0-000026.D o表1-2 杂质和XXX分离度测试出峰顺序名称保留时间（min）分离度R1杂质C2.218-2杂质XA5.21621.03XXX7.78612.44杂质D11.47613.35杂质A12.0691.8表1-3xxx加入已知杂质的分离度测试出峰顺序名称保留时间（min）

16、RRT分离度R1杂质C2.2120.28-2杂质XA5.2100.6721.13XXX7.7951.012.64杂质D11.4751.4713.25杂质A12.0661.551.83.1.6专属性评价标准1）溶剂对杂质的测定无明显干扰；2） 杂质A和杂质D的分离度不小于1.0;其它每个相邻组分之间的分离度R均应大于1.5;3.1.7验证结果及评价溶剂对杂质的测定没有干扰，XXX与相邻杂质 XA和杂质D的分离度依次为21.1和13.2,较相 邻的杂质D和杂质A的分离度为1.8,杂质XB和XC的分离度为1.6,均大于1.5,表明XXX与每个 杂质以及每个杂质之间分离度均符合要求。方法的专属性符合验

17、证标准。3.2系统适用性试验3.2.1按照X X X色谱纯度分析方法进行：3.2.2分离度：系统平衡后，取系统适用性溶液进样，记录色谱图，3-苯甲酰基苯甲酸和XXX的相对保留时间依次约为 0.8和1.0;计算3-苯甲酰基苯甲酸和xxx的分离度。以xxx峰计算色谱柱的理 论塔板数N和拖尾因子T。色谱图见KP0-000039.D o3.2.4重复性标准溶液连续进样6次，记录色谱图，计算主峰面积的RSD。测定数据和结果见表 2-1。色谱图见KP0-000040.D KP0-000045.D 。3.2.3验证合格标准1) 以XXX峰计算色谱柱的理论塔板数N,应不少于2250;2) XXX峰的拖尾因子

18、T,不大于2.0;3) 3-苯甲酰基苯甲酸和XXX的分离度R至少为4;4) 标准溶液连续进样 6次，其主峰面积的 RSD< 5%。3.2.4系统适用性试验结果及评价：在系统适用性溶液的色谱图中，3-苯甲酰基苯甲酸和 。司的分离度R为13.3,大于4;以X2峰计算色谱柱的理论塔板数 N为20328,大于2250; XX><的拖尾因子 T为0.83，小于2.0;标准溶液连续 进样6次，其主峰面积的 RSD为0.51%,小于5%。方法的系统适用性试验符合验证标准。表2-1系统适用性试验数据No.123456平均值峰面积67.9368.3867.7668.7568.1668.1268

19、.18标准偏差S0.35RSD0.51%分离度R13.3理论塔板数N20328拖尾因子T0.833.3精密度3.3.1重复性3.3.1.1以方法规定的色谱条件，取线性项下 No.5线性标准溶液，连续进样6次，记录色谱图，计算各组分峰面积的平均值、标准偏差S和RSD。以RSD评价方法的重复性。数据及结果见表3-1。色谱图见 KP0-000014.D KP0-000019.D。3.3.1.2验证合格标准：标准溶液连续重复 6次进样，各组分峰面积的相对标准偏差RStM 5%3.3.1.3重复性验证结果及评价标准溶液重复进样 6次，杂质C,杂质XA, XXX ,杂质D,杂质A峰面积的RSD依次为0.2

20、4%,0.41%, 0.51%, 0.54%, 0.21%, 1.6%和0.86%,均小于5%,方法的重复性符合标准。3.3.2中间精密度另日，由另外一个化验员，按照线性项下No.5线性标准溶液的制备方法配制相同浓度的溶液，在相同的仪器上连续进样 6次，记录色谱图。计算各组分峰面积的平均值、标准偏差S和RSD,以RSD评价方法的中间精密度，数据及结果见表3-2。色谱图见 KP0-000014.DKP0-000019.D。3.3.2.2验证合格标准:RStM 5%标准溶液连续重复6次进样，各组分峰面积的相对标准偏差3.3.2.3中间精密度验证结果及评价标准溶液重复进样 6次，杂质C,杂质XA,

21、XXX ,杂质D,杂质A峰面积的RSD依次为0.20%, 0.23%, 0.60%, 0.60%, 0.24%, 1.1%和0.49%,均小于5%;方法的中间精密度符合标准。3.3.3精密度的显著性评价使用F-检验的方法，评价在精密度方面，方法的重复性和中间精密度有无显著性差异。3.3.3.1 步骤(1) 取各组分重复性和中间精密度项下的峰面积的标准偏差S;(2) 选择显著性水平 a =0.05 ;(3) 从表3-1和表3-2获得峰面积的标准偏差S,确定S和S2 (S>S);(4) 计算 F 值，F = S i2/S22；(5) 计算自由度(n 2-1,n 1-1)=(5, 5), n2

22、= m= 6;(6) 查阅在a =0.05，自由度为(5,5)，单侧检验的 F0= 5.05 ;(7) 数据和结果见表3-3。3.3.3.2验证合格标准每个组分的F应小于F。，即表明方法的重复性和中间精密度之间无显著性差异。3.3.3.3验证结果及评价每个组分的F应小于F。，表明方法中间精密度和重复性之间的精密度无显著性差异。3.3.4精密度验证结果及评价标准溶液重复进样 6次，在重复性项下，杂质 C,杂质XA, XXX ,杂质D,杂质A,杂质XB和 杂质 XC 峰面积的 RSD 依次为 0.24%, 0.41%, 0.51%, 0.54%, 0.21%, 1.6% 和 0.86%,均小于 5

23、%;在 中间精密度项下测得的 RSD依次为0.20%, 0.23%, 0.60%, 0.60%, 0.24%, 1.1%和0.49%,均小于5%; F-test结果表明，每个组分的F值均小于Fo值5.05,表明方法的中间精密度和重复性之间的精密度无显著性差异。方法的精密度符合验证标准。表3-1重复性试验数据组分峰面积平均值SRSD123456杂质C125.75126.03126.08126.63126.27125.99126.130.2970.24%杂质XA170.09170.75170.79170.99171.92169.98170.750.7010.41%XXX72.3071.5871.8

24、372.1872.6372.2272.120.3690.51%杂质D55.7255.8155.8056.0155.9955.1855.750.3020.54%杂质 A308.44307.59308.16308.36307.76306.72307.840.6410.21%表3-2中间精密度试验数据组分峰面积平均值SRSD123456杂质C126.28126.15126.07126.60126.30126.70126.350.2490.20%杂质XA170.92171.07171.30170.39171.52171.17171.060.3870.23%XXX72.7072.1872.5871.67

25、72.1571.6772.160.4360.60%杂质D56.5756.3355.6156.3556.1256.4356.240.3400.60%杂质A309.00308.71308.40309.97308.92310.23309.200.7280.24%表3-3重复性和中间精密度有无显著性差异的评价组分名称重复性的S中间精密度的SF=Si2/S22 (Si>S2)接受标准Fo结论杂质C0.2970.2491.425.05合格杂质XA0.7010.3873.285.05合格XXX0.3690.4361.405.05合格杂质D0.3020.3401.275.05合格杂质A0.6410.72

26、81.295.05合格3.4线性及范围3.4.1溶液制备3.4.1.1标准贮备液分别精密称取以下标准品：杂质 A、杂质C、杂质D、杂质XA、杂质XB、杂质XC和XXX标 准品适量，分别至一个容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，混合均匀，得到每个组分的标准贮备液。每个成分的浓度均约为 0.10mg/ml。（备注：为保证线性范围，浓度应充分精确，并根据含量折纯）3.4.1.2标准贮备溶液（a）:分别量取每个杂质和XXX的标准贮备液各5.0ml,至一个50.0ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，混合均匀。每个组分的浓度均约为10v,ml。3.4.1.3标准溶液分别取标准贮备溶液 （a） 0.5ml,

27、1.0ml, 2.0ml, 4.0ml, 5.0ml, 6.0ml各至一个25.0ml容量瓶，用流动相稀释至刻度，混合均匀，得到No.1No.6标准溶液。每个杂质和XXX的浓度范围均约为0.24 Mml,相当于杂质含量在0.02%0.24%。3.4.2测定分别取No.1No.6标准溶液，分别进样，每个浓度连续进2次，记录色谱图至最后一个组分出峰为止。浓度、峰面积及实验结果见表4-1表4-7。3.4.3线性回归以各组分峰面积平均值对其浓度（ 卬矿ml），使用origin 5.0软件进行线性回归，得到各组分的标准曲线，线性方程及相关系数R。线性测试数据及结果见表4-14-7。3.4.4验证合格标准

28、：在每个组分的线性范围内，各组分峰面积与浓度均应呈线性关系，相关系数R>0.999。3.4.5线性验证结果及评价杂质A的含量在0.02%0.24%的范围时，它的线性方程为 Y=153.713X-0.214，相关系数为0.99996; 杂质C的含量在0.02%0.24%的范围时，它的线性方程为Y=62.854X-0.236，相关系数为 0.9999;杂质D的含量在0.02%0.24%的范围时，它的线性方程为Y=27.520X-0.423，相关系数为 0.9999;杂质XA的含量在0.02%0.24%的范围时，它的线性方程为Y=86.007X-0.725，相关系数为 0.9999;代表其它杂

29、质的XXX含量在 0.02%0.25%的范围时，它的线性方程为Y=33.579X-0.558，相关系数为 0.9998;每个杂质的相关系数均大于0.999,表明它们的峰面积与浓度均呈线性关系。方法的线性和范围符合验证标准。表4-1线性测试的数据和结果溶液No.杂质A浓度（卬何）峰面积平均 峰面积1210.200031.0330.9631.0020.400062.7462.3362.5330.8000121.46120.51120.9941.600243.78245.15244.4552.000309.36306.51307.9462.400367.92370.63369.28范围（卬g/ml）

30、0.22.4范围（%）0.020.24线性方程Y=153.713X-0.214相关系数R0.99996回归直线Linear Regression for Data of Impurity A:Y = A + B * XParameterValueErrorA-0.214131.00483B153.712810.67848RSDNP0.999961.362616<0.0001表4-2线性测试的数据和结果溶液No.杂质C回收率测试数据及结果见表5-15-7 。浓度(Mml)峰面积平均 峰面积1210.200012.7412.7212.7320.400025.6725.6325.6530.80

31、0048.7948.9948.8941.60099.3599.6499.5052.000126.15125.57125.8662.400150.63151.51151.07范围(卬g/ml)0.22.4范围(%)0.020.24线性方程Y=62.854X-0.236相关系数R0.9999200AMV6 4 2 0 0.00.51.01.52.02.5Concentration(ug/ml)回归直线Linear Regression for Data of Impurity C:Y = A + B * XParameterValueErrorA-0.236050.64896B62.853550.

32、43819RSDNP0.99990.880036<0.00013.5准确度3.5.1以中间精密度项下No.5线性标准溶液为标准，按照以下公式，计算线性项下 No.2No.6溶液中每个组分的回收率，并计算平均回收率。未知杂质的回收率以XXX的进行评价。3.5.2计算公式: _ Ai 如 回收率(%)= X100% Asi G注：Ai: No.2No.6线性标准溶液中每个组分的平均峰面积；Asi: No.5线性标准溶液中每个组分的平均峰面积；Ci: No.2No.6线性标准溶液中每个组分的浓度，卬矿ml.Csi: No.5线性标准溶液中每个组分的浓度，gml.3.5.3可接受标准：每个组分的

33、平均回收率：95.0%105.0%。3.5.4准确度验证结果及评价杂质A、杂质C、杂质D、杂质XA、杂质XB、杂质XC和XXX的回收率依次为99.4%, 99.2%, 98.5%,99.0%, 98.7%, 98.5% 和 100.5%，回收率的 RSD 依次为 1.2%, 1.8%, 1.4%, 1.8%, 2.9%, 2.5% 和 2.4%;每个杂质的回收率均介于95.0%105.0%之间。方法的准确度符合验证标准。表5-1杂质A回收率测定数据和结果标准溶液浓度 CSi (卬矿ml)2.000标准平均峰面积ASi309.20溶液No.23456浓度 Ci ("ml)0.40000