二张基因工程制药目的基因的分离PPT课件

1、1q 分离目的基因的方法及原理分离目的基因的方法及原理q 目的基因分离方法的选择原则目的基因分离方法的选择原则q 目的基因的序列测定目的基因的序列测定第1页/共57页2 cloned DNA in vitro第一节第一节 分离目的基因的方法及原理分离目的基因的方法及原理1第2页/共57页3第3页/共57页4目的基因的来源目的基因的来源片段片段探针筛选探针筛选提纯提纯扩增扩增 第4页/共57页第5页/共57页6第6页/共57页7第7页/共57页8第8页/共57页9第9页/共57页10第10页/共57页11第11页/共57页12第12页/共57页第13页/共57页14第14页/共57页方法：合成c

2、DNA第一链 5AAAAAA 3 mRNA TTTTTTT 5 cDNA 1 Oligo(dT)，反转录酶 d NTP, 合成cDNA第二链 AAAAAA 3 cDNA 2 TTTTTTT 5 RNase H，DNA聚合酶, dNTP 5 AAAAAA 3 双链 cDNA 3 TTTTTTT 5第15页/共57页第16页/共57页第17页/共57页18第18页/共57页19第19页/共57页20第20页/共57页21第21页/共57页22第22页/共57页23第23页/共57页24第24页/共57页2523第25页/共57页26接接第26页/共57页27 第27页/共57页28第28页/共57

3、页29第29页/共57页30 （见PCR章）4第30页/共57页31第31页/共57页差示文库构建流程F细胞mRNA。 F细胞中特异表达的cDNA文库（即差示文库）（F细胞cDNA第一链）代表F细胞特异表达的基因（H细胞mRNA） 。 。 。第32页/共57页33第33页/共57页34第34页/共57页35一、根据获得目的基因的目的选择方一、根据获得目的基因的目的选择方法法第35页/共57页36二、根据目的基因的特点选择方法二、根据目的基因的特点选择方法第36页/共57页37三、根据实验室的设备和条件选择方法三、根据实验室的设备和条件选择方法第37页/共57页38第三节第三节 目的基因序列测定

4、目的基因序列测定第38页/共57页39一、双脱氧链终止法（一、双脱氧链终止法（SangerSanger法）法） 第39页/共57页40第40页/共57页41第41页/共57页5GAGTCACACTTGAC 3待测单链DNA 3CTG 5引物、Klenow酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和少量-32P-dATP 加ddATP反应3ACTG 53AACTG 53AGTGTGAACTG 5加ddCTP反应3CAGTGTGAACTG 53CTCAGTGTGAACTG5加ddTTP反应3TGAACTG 53TGTGAACTG 53TCAGTGTGAACTG5加ddGTP反应3GAACTG 53

5、GTGAACTG 53GTGTGAACTG5GAGTCACACTT变性凝胶电泳、放射自显影 A C T G 5第42页/共57页43第43页/共57页44第44页/共57页45 第45页/共57页46 第46页/共57页47第47页/共57页48第48页/共57页49二、化学裂解法（二、化学裂解法（Maxam-GilbertMaxam-Gilbert法）法） 原理原理 使特定的碱基首先被化学修饰，然后再经化学使特定的碱基首先被化学修饰，然后再经化学处理。如：用硫酸二甲酯使鸟嘌呤甲基化，然处理。如：用硫酸二甲酯使鸟嘌呤甲基化，然后再加哌啶，使甲基化的鸟嘌呤丢失，后再加哌啶，使甲基化的鸟嘌呤丢失，

6、DNADNA链链从鸟嘌呤修饰处后的从鸟嘌呤修饰处后的3 3，5 5- -磷酸二酯键断裂。磷酸二酯键断裂。第49页/共57页50 自动测序仪基于自动测序仪基于2 2，3-3-双脱氧末端终止法的原理，双脱氧末端终止法的原理，标记系统由放射性核素改为发特定荧光信号的荧光标记系统由放射性核素改为发特定荧光信号的荧光染料，预先将四种荧光染料与四种双脱氧核苷三磷染料，预先将四种荧光染料与四种双脱氧核苷三磷酸共价相连，使其带有不同的荧光标记。当某一种酸共价相连，使其带有不同的荧光标记。当某一种ddNTPddNTP掺入到正在合成的掺入到正在合成的DNADNA单链分子中时，该单链分子中时，该链的延伸便终止并带有相应的荧光染料。链的延伸便终止并带有相应的荧光染料。 自动测序系统包括电泳分离系统、荧光检测装自动测序系统包括电泳分离系统、荧光检测装置、计算机成像系统及分析软件组合。置、计算机成像系统及分析软件组合。6第50页/共57页51序序 列列 图图 谱谱(AB