ELISA和ELISPOT检测技术PPT课件

1、酶联免疫吸附试验 (ELISA)ELISA技术简介ELISA的基本原理ELISA的类型和方法ELISA方法注意事项和应用第1页/共38页酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) ： 基于抗原-抗体反应的特异性和等比例性，是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附（包被）在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板，也称酶标板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，加入相应的酶底物后发生颜色反应，通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，通过颜色

2、反应的深浅检测标本中相应抗体或抗原含量的检测技术 。 第2页/共38页ELISA的发展概况 自从Engvall和Perlman（瑞典，1971）首次报道建立酶联免疫吸附试验（ELISA）以来，由于ELISA技术具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。 随着生物技术的快速发展，将利用基因工程技术制备的抗原或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了ELISA检测技术的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。 目前，ELISA检测技术在科学研究、疾病诊断、检验检疫、环境监测等诸多领域广泛应

3、用。第3页/共38页ELISA的基本原理 酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过分光光度计进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 基本原理第4页/共38页ELISA试剂盒的组成完整的ELIS

4、A试剂盒通常包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（俗称酶标板）；（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；（3）酶的底物；（4）参考标准品（定量试剂盒）及其稀释液；（5）酶标记物及样本的稀释液；（6）洗涤液（通常为浓缩液，用前按比例稀释）；（7）反应终止液；（8）封口膜若干、说明书一份。第5页/共38页酶标板第6页/共38页ELISA常用酶类辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)DH2+ H2O2 D + H2O上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。常用底物： 1. 邻苯二胺(OPD)，产物为橙红色（492nm检测）； 2. 四甲基联苯胺(TMB)

5、，产物为蓝色，酸性条件下变为 黄色（450nm检测）。反应终止液：HCl或H2SO4溶液。第7页/共38页碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)常用底物： 1. 对硝基苯磷酸酯 ( p-NPP )，产物为黄色的对硝基酚 （405nm检测）； 2. 发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于荧光测定，灵敏度高于显色底物的方法。反应终止液：NaOH 溶液。第8页/共38页ELISA所需仪器设备恒温箱洗板机酶标仪第9页/共38页ELISA的类型和方法半定量ELISA试验定量ELISA试验试验目的试验性质间接法双抗夹心法 (直接夹心法)BAS-ELISA双夹心法 (间接夹心法)竞争

6、法ELISA直接法第10页/共38页 直接法ELISA是将酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原-抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量（见后图） 。该方法可用于检测抗体或抗原。 直接法ELISA优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。 需制备各种酶标抗原或抗体。第11页/共38页间接法ELISA 间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗和

7、抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。 该方法可用于抗体检测，是目前检测抗体最常用的ELISA方法。优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体; 2. 制备方便，价格便宜。第12页/共38页双抗夹心法ELISA 双抗夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出捕获的抗原量，本方法也称为直接夹心法（见后图） 。 该方法可用于抗原检测，例如细胞因子、激素、蛋白质、细菌、病毒等，是目前检测抗原最常用的ELISA方法。优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体。 2. 制

8、备方便，价格便宜。第13页/共38页双夹心法ELISA 双夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，然后用未标记的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-未标记抗体复合物；再应用酶标二抗和抗体-抗原-未标记抗体复合物结合，形成抗体-抗原-未标记抗体-酶标二抗复合物，也称为间接夹心法（见后图）。 该方法可用于抗原检测，例如蛋白质、病原体等。优点: 1. 灵敏度高。 2. 制备方便，无需制备特殊的酶标抗体。缺点: 实验操作较复杂。第14页/共38页第15页/共38页BAS-ELISA BAS-ELISA即生物素-亲和素系统（biotin avidin system, BAS）ELISA法：是先将

9、抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，然后用生物素（biotin）标记的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-生物素标记抗体复合物，再依次加入亲和素、酶标记生物素（或直接加入酶标记的亲和素），最后加底物显色。 生物素是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅酶R或维生素H。亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度亲和力，即一个亲和素可以结合4个生物素分子。因此，本方法具有信号放大功能（特点）。 该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。第16页/共38页BAS-ELISA实验原理第17页/共38页竞争法ELISA 竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，

10、在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从而

11、进一步得知样本中抗原的多少。第18页/共38页测定孔EEEEE酶标记物底物溶液对照孔EEEEEEEEEEEEEEE酶标记物底物溶液参考液(不含抗原)EE样本(含抗原)竞争法ELISA实验原理第19页/共38页半定量ELISA试验第20页/共38页间接法检测血清HBsAb含量设计加板次序(空孔、阴、阳)加板(阴、阳、样)37, 30min加酶标抗体(空孔除外)洗涤3次，拍干加底物溶液(空孔除外)37, 10-30min加终止液(空孔除外)避光上机检测、结果判定(空孔调零)37, 30min洗涤3次，拍干第21页/共38页双抗夹心法检测血清IL-2含量设计加板次序(空孔、阴、阳、标准)加板(阴、阳

12、、标准、样)37, 30min加酶标抗体(空孔除外)洗涤3次, 拍干加底物溶液(空孔除外)37, 10-30min加终止液(空孔除外)避光上机检测、绘制标准曲线(空孔调零)从标准曲线上读取样品含量37, 30min洗涤3次, 拍干第22页/共38页ELISA试验中的注意事项必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验试剂盒的质量；待测样品应设立双复孔或三复孔；半定量（或定性）ELISA中结果判断依据通常为：OD样/OD阴2.1时为阳性结果，2.1时为阴性；酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性；定量ELISA中每一批次的试剂盒必须绘制一个标准曲线；定量ELISA中还应特别注意试剂盒的灵敏度

13、(测定范围)。第23页/共38页ELISA试验的应用抗体及抗体亚类检测（包括血清、制备的抗体溶液等）抗原检测（包括制备的抗原、毒素、病原体等）；激素及其他生物活性分子检测（如HCG检测等）；细胞因子及其受体检测（人、小鼠、大鼠等来源）；BAS-ELISA还可用于核酸（DNA/RNA）检测；第24页/共38页酶联免疫斑点试验（ELISPOT）ELISPOT技术简介ELISPOT的基本原理ELISPOT的实验方法ELISPOT技术的应用第25页/共38页ELISPOT技术简介 酶联免疫斑点试验( Enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) 随着酶联免疫分析技术

14、在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时，以往常用ELISA方法检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的CK或循环抗体的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK 的水平。80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。 第26页/共38页ELISPOT的发展概况Sedgwich J

15、D (澳大利亚)和Czerkinsky CC (瑞典)等人几乎同时在1983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。 底板材料的发展：普通塑料板(1983) 硝酸纤维素膜 (NC膜, 1985) 聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜) 透明板(1997, 荷兰U-Cytech公司)抗体制备技术的发展：上世纪90年代后抗体制备技术提升。检测内容的发展：由抗体检测向细胞因子检测。发展趋势：1. 多种细胞因子在同一孔板中同时检测。 2. 试验操作的标准化、规范化。第27页/共38页ELISPOT的技术特点灵敏度高：在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。是目前最为灵

16、敏 的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级 。 单细胞水平，活细胞功能检测 ：检测的是单个活细胞分泌功能，而非细胞群体的 平均分泌功能。 操作简便经济，可以进行高通量筛选 ：没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样 品，效率远远高于其它检测方法 。第28页/共38页ELISPOT的基本原理 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与酶标记（例如碱性磷酸酶）的亲和素结合。底物（BCIP/NBT，产物为蓝紫色）

17、孵育后，PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 酶联斑点分析系统对斑点分析后得出结果。 第29页/共38页 稳定、特异，且抗原用量少 可同时检测不同抗原诱导的 抗体分泌，并可定量检测 可检测组织切片中分泌抗体 的单个细胞ELISPOT第30页/共38页ELISPOT试验操作流程设计实验、包被ELISPOT板接种细胞、加入刺激物（正、负、背景对照）37, 5%CO2吸弃培养上清裂解细胞低渗法拍干后，加入生物素标记抗体依次加入亲和素、酶标生物素和底物第2天培养18-24hr第3天PBS洗10遍斑点扫描分析第31页/共38页第32页/共38页ImmunoSpot AnalyzerImmunoScan ELISPOT分析系统第33页/共38页ELISPOT技术的应用疫苗研究开发(包括预防性、治疗性), 如HIV疫苗研究；临床指导（包括疾病诊断、药物疗效等）；基础研究：机体免疫系统功能、癌症免疫机制等。第34