DNA复制基础知识PPT课件

1、第四章 DNA 复 制DNA Replication1 引言引言-基因组复制与细胞分裂的关基因组复制与细胞分裂的关系系2 复制子复制子3 DNA复制的几种形式复制的几种形式4 DNA聚合酶聚合酶5 原核生物原核生物DNA复制的基本过程复制的基本过程6 真核生物真核生物DNA复制复制7 DNA复制的调控复制的调控8 小小 结结第1页/共71页 重点内容：重点内容： 几个重要概念：几个重要概念：DNA的复制、复制子、复制眼、的复制、复制子、复制眼、复制叉、复制叉、DNA聚合酶、聚合酶、DNA的半保留复制、的半保留复制、DNA的半不连续复制、的半不连续复制、DNA的先导链、的先导链、DNA的后随链、

2、的后随链、冈崎片段；冈崎片段；不同生物基因组复制子数目；不同生物基因组复制子数目；线性线性DNA复制末端问题的提出及解决方案；复制末端问题的提出及解决方案；-复制、复制、滚环复制及滚环复制及D-环复制的机制；环复制的机制；大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合聚合酶酶 I、II、 III 的性质比较，的性质比较，DNA聚合酶聚合酶与缺口与缺口平移法制备探针；平移法制备探针；DNA复制的起始、延伸及终止。复制的起始、延伸及终止。 了解内容：了解内容： 基因组复制与细胞分裂的关系；基因组复制与细胞分裂的关系；复制叉移动复制叉移动方向的确定；真核生物方向的确定；真核生物DNA聚合酶的种类及各自的聚合酶的种类及各

3、自的功能；功能；DNA复制的调控。复制的调控。 第2页/共71页1 1 引言引言-基因组复制与细胞分裂的关基因组复制与细胞分裂的关系系 细胞细胞在每次分裂的过程中，在每次分裂的过程中，整个基因组都必须精确地复制一次整个基因组都必须精确地复制一次。 如何保证这一点？如何保证这一点？两个原则两个原则 (1) DNA复制的启动决定了细胞的进一步分裂复制的启动决定了细胞的进一步分裂; (2) 复制过程完成前，细胞是不会发生分裂的。复制过程完成前，细胞是不会发生分裂的。第3页/共71页2 复制子复制子(replicon)2.1 复制子的定义2.2 不同生物复制子的数目2.3 复制眼概念2.4 复制叉概念

4、及其移动方向的实验确定2.5 复制的模式-起点、方向和速度第4页/共71页2.1 复制子的定义DNADNA中发生一次复制的单位称为复制子中发生一次复制的单位称为复制子(replicon) (replicon) 。 复制子是根据它含有复制所需的控制元件来定义复制子是根据它含有复制所需的控制元件来定义的，在复制启动位点具的，在复制启动位点具起始点（起始点（origin)origin)，在复制，在复制终止位点具终止位点具终点（终点（terminus)terminus)。起始点仅作用于所。起始点仅作用于所在复制子。在复制子。 注：注：在每个细胞周期中，每个复制子发生一次在每个细胞周期中，每个复制子发生

5、一次复制，且只发生一次。复制，且只发生一次。第5页/共71页质粒一般质粒一般是一个自主环状的是一个自主环状的DNADNA基因基因组，构成一个独立复制子；组，构成一个独立复制子；原核生物原核生物基因组中一般只含一个复制基因组中一般只含一个复制子，在唯一的起始点启动就会引起整子，在唯一的起始点启动就会引起整个基因组复制；个基因组复制；真核生物真核生物基因组含多个复制子（一般基因组含多个复制子（一般40-100kb/40-100kb/个）。个）。 2.2 不同生物复制子的数目第6页/共71页2.3 复制眼概念 复制眼：在一个长的未复制区域内DNA已经复制的区域第7页/共71页Replication

6、eye第8页/共71页复制叉:双螺旋DNA两条亲本链分开使复制能进行的部位。2.4 复制叉的概念及其移动方向的确定第9页/共71页复制叉移动方向的确定放射性自显影法：放射性自显影法：对于大基因组内的不确定区域，对于大基因组内的不确定区域，两次连续的放射脉冲可以用来标两次连续的放射脉冲可以用来标记复制的移动。如果一个脉冲比记复制的移动。如果一个脉冲比另一个脉冲强，我们可以用相对另一个脉冲强，我们可以用相对的标记强度来区分，这些可用放的标记强度来区分，这些可用放射自显影观察。射自显影观察。单向复制：单向复制：在复制眼的一端，一在复制眼的一端，一种类型的标记后紧跟着另一种标种类型的标记后紧跟着另一种

7、标记；记；双向复制：双向复制：在复制眼的两端产生在复制眼的两端产生一种（对称的）模式。在真核生一种（对称的）模式。在真核生物中普遍存在。物中普遍存在。第10页/共71页2.5 2.5 复制的模式复制的模式-起点、方向和速度起点、方向和速度单起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向多起点、双方向第11页/共71页3 DNA复制的几种形式3.1 线性DNA双链的复制3.2 环状DNA双链的复制 第12页/共71页3.1 线性DNA双链的复制线性DNA复制的具体表现线性DNA复制时末端问题的提出线性DNA复制时末端问题的解决方案第13页/共71页线性DNA复制的具体表现第14页/共71页 线性DNA

8、复制时末端问题的提出 所有已知的核酸聚合酶，无论是所有已知的核酸聚合酶，无论是DNA聚合酶还是聚合酶还是RNA聚合聚合酶都只从聚合聚合酶都只从5端向端向3端移动，端移动，新链的合成方新链的合成方向与聚合酶移动方向一致，即只能是向与聚合酶移动方向一致，即只能是5 3； 而对于而对于DNA的合成必需一段的合成必需一段引物引物的存在，体内的存在，体内DNA复制时，由一段复制时，由一段RNA引物起始引物起始DNA合成，起始后它必须合成，起始后它必须切除，切除后，切除，切除后，5端如何起始呢？端如何起始呢？ 这就提出了这就提出了线性线性DNA末端复制末端复制的问题。的问题。第15页/共71页第16页/共

9、71页复制能在新合成链的3端结束，它如何在5端启动呢？第17页/共71页 线性线性DNADNA复制时末端问题的解决方案复制时末端问题的解决方案(1(1）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。如如噬噬菌体：滚环产生多聚复制子）；菌体：滚环产生多聚复制子）；(2(2）某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动。几种线性病毒核酸具有与几种线性病毒核酸具有与55端碱基共价结合的蛋白质，其中端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清楚的例子是腺病毒了解最清楚的例子是腺病毒 DNA )DNA )。(3(3）DNADNA可形成特殊的结构，

10、如在末端形成发夹。可形成特殊的结构，如在末端形成发夹。使分使分子没有游离末端。草履虫（子没有游离末端。草履虫（ParameciumParamecium）的线性线粒体的线性线粒体DNADNA的复的复制中就形成了一种交联；制中就形成了一种交联；(4(4）末端是可变的，而不是精确确定的。末端是可变的，而不是精确确定的。真核生物染色真核生物染色体可能采用这种方式，在这种情况下，体可能采用这种方式，在这种情况下，DNADNA末端的短重复序列末端的短重复序列的拷贝数改变（如端粒的复制）；的拷贝数改变（如端粒的复制）；第18页/共71页（1）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子第19页/共71页The ro

11、lling circle replicates DNAPhage 第20页/共71页A rolling circle appears as a circular molecule with a linear tail by electron microscopy. 第21页/共71页第22页/共71页Adenovirus terminal protein binds to the 5 end of DNA and provides a C-OH end to prime synthesis of a new DNA strand.（2） 某种蛋白质介入而在真正的末端启动复制第23页/共71页A

12、denovirus DNA replication is initiated separately at the two ends of the molecule and proceeds by strand displacement. 第24页/共71页A typical telomere has a simple repeating structure with a G-T-rich strand that extends beyond the C-A-rich strand. The G-tail is generated by a limited degradation of the

13、C-A-rich strand.（4） 末端长度可变第25页/共71页A loop forms at the end of chromosomal DNA.第26页/共71页The 3 single-stranded end of the telomere (TTAGGG)n displaces the homologous repeats from duplex DNA to form a t-loop. 第27页/共71页Watching flash第28页/共71页3. 2 环状DNA的复制-复制滚环复制D-环复制第29页/共71页复制 replication by -structure

14、第30页/共71页滚环复制replication by rolling cycles structure X174X174噬菌体由一个单链环状噬菌体由一个单链环状DNADNA组成，这条链称为正（组成，这条链称为正（+ +）链；合成的互补链称为负）链；合成的互补链称为负（一）链。双链体的复制以滚环复制方式进行。（一）链。双链体的复制以滚环复制方式进行。第31页/共71页The A protein is cis-acting第32页/共71页环复制Replication by displacement loop structure第33页/共71页D-环复制（Replication by disp

15、lacement loop structure)第34页/共71页4 DNA聚合酶4.1 大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能4.2 真核生物DNA聚合酶的种类及其功能4.3 DNA聚合酶所具有的共同结构第35页/共71页4.1 大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能SOS 修复第36页/共71页大肠杆菌DNA聚合酶 I、II、 III 的性质比较第37页/共71页（1）DNA聚合酶聚合酶 I 103 kDa的单链多肽，可以被蛋白酶切成两段，C端的2/3包括聚合酶活性位点；N端的1/3包含核酸外切酶校正活性（一次可切除1-10个碱基）。（2） 利用DNA聚合酶 I 进行缺口平移法制备探针的基本原理聚

16、合酶聚合酶 I 与缺口平移法制备探针与缺口平移法制备探针第38页/共71页Nick translation replaces part of a pre-existing strand of duplex DNA with newly synthesized material. DNase 第39页/共71页4.2 真核生物DNA聚合酶的种类及其功能第40页/共71页第41页/共71页真核生物由不同DNA聚合酶分别负责起始和延伸三种细胞核DNA复制酶具有不同的功能: DNA polymerase 起始新链合成DNA polymerase 延伸先导链DNA polymerase 可能与后随链合成

17、有关，也可能具有其他功能 第42页/共71页4.3 DNA聚合酶所具有的共同结构许多DNA聚合酶有一个由三个结构域组成的大裂隙，类似于手形。第43页/共71页The common organization of DNA polymerases has a palm that contains the catalytic site, fingers that position the template, a thumb that binds DNA and is important in processivity, an exonuclease domain with its own activ

18、e site, and an N-terminal domain.第44页/共71页5 原核生物原核生物DNADNA复制的基本过程复制的基本过程5.1 DNA复制的起始5.2 DNA合成链的延伸5.3 DNA复制的终止第45页/共71页单链DNA的产生3-OH引发末端的产生复制复合体的形成 5.1 DNA复制的起始第46页/共71页单链DNA的产生解旋酶(helicase): 使DNA的两条链分开，它通常利用ATP水解来提供必需的能量；第47页/共71页拓扑异构酶 （DNA Topisomerase ） 拓扑异构酶的种类分为拓扑异构酶的种类分为型和型和型。型。 原核拓扑构酶原核拓扑构酶： MW

19、=100kD，单肽链，含，单肽链，含34个个Zn。 作用是暂时切断一条作用是暂时切断一条DNA链，形成酶链，形成酶-DNA共价中间物而使超螺旋共价中间物而使超螺旋DNA松弛，然后再松弛，然后再将切断的单链将切断的单链DNA连接起来。每次改变一个连环数。连接起来。每次改变一个连环数。第48页/共71页第49页/共71页拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶也称旋转酶。广泛也称旋转酶。广泛存在于各种生物中。存在于各种生物中。 使正超螺旋转化为负超螺旋，每使正超螺旋转化为负超螺旋，每次改变两个连接数。次改变两个连接数。第50页/共71页Replication machineryreplicati

20、onPositive supercoilBreak DNATopoisomerase IIpass DNA through the breaknegative supercoil第51页/共71页单链结合蛋白（single-strand binding protein):单链DNA结合，阻止其再形成双链体状态X174 噬菌体的DNA在三种功能蛋白先后作用下分开成为单链：在复制起始点，噬菌体A蛋白使病毒（+）链产生缺口。Rep蛋白提供解旋酶活性，它使两链分离。SSB包绕单链形成稳定的单链形式。Three proteins unwind X174 DNA第52页/共71页引发末端的产生第53页/共

21、71页多种方法可以产生3-OH末端1)1)3)3)2)2)第54页/共71页第55页/共71页5.2 DNA合成链的延伸半保留复制合成两条新的DNA链DNA的合成是半不连续的连接酶将冈崎片段连接在一起前导链和后随链的协调合成 DNA复制忠实性的控制 第56页/共71页(1) 半保留复制的概念 DNA在复制时，两条链解开分在复制时，两条链解开分别作为模板，在别作为模板，在DNA聚合酶的聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以两条与模板链互补的新链，以组成新的组成新的DNA分子。这样新形分子。这样新形成的两个成的两个DNA分子与亲代分子与亲代DNA分子

22、的碱基顺序完全一样。由分子的碱基顺序完全一样。由于子代于子代DNA分子中一条链来自分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制这种复制方式称为半保留复制 (semiconsertive replication)。第57页/共71页(2)半保留复制实验证据（Meselson-Stahl) 19581958年年Meselson Meselson & stahl& stahl用同位素用同位素（1515N N）示踪标记示踪标记加密度梯度离心技加密度梯度离心技术术实验实验, ,该实验跟该实验跟踪了生长了三代的踪了生长了三代的大肠杆菌，大肠

23、杆菌，证明了证明了DNADNA是采取半保留是采取半保留的方式进行复制的方式进行复制。15N15N-14N14N15N-14N15N-14N第58页/共71页的合成是半不连续的（semidiscontinuous replication) DNA 复制在合成先导链（leading strand) 时是连续的；而在合成后随链(lagging strand)时是先形成小片段（ Okazaki fragment ），随后再将它们连接而成大片段。因后随链是不连续合成的而先导链是连续合成的，所以我们称之为半不连续复制（semidiscontinuous replication)。第59页/共71页两条新链

24、具有不同的特征The two new DNA strands have different featuresOkazaki fragment第60页/共71页连接酶（Ligase)将Okazaki fragment连接在一起第61页/共71页前导链(Leading strand)和后随链(lagging strand)的协调合成第62页/共71页聚合酶控制复制的忠实性第63页/共71页DNA聚合酶造成的复制错误可分为两类：聚合酶造成的复制错误可分为两类：移码（移码（frameshift): 指一个核苷酸的插入或缺失。指一个核苷酸的插入或缺失。替换（替换（substitution): 指掺入错误核苷酸（不正确配对）指掺入错误核苷酸（不正确配对）Note: DNA聚合酶通常具有聚合酶通常具有3-5核酸外切酶活性，可以切除错配碱基；通过校正机制，复制核酸外切酶活性，可以切除错配碱基；通过校正机制，复制忠实性还可提高忠实性还可提高100倍。倍。(10-310-8-10-10)第64页/共71页 细菌的DNA聚合酶仔细检查延长链末端的碱基对，如果是错误的会予以切除。DNA polymerases have exonuclease activity第65页/共71页 修复会把