DNA重组技术的基本工具精华PPT课件

1、第1页/共46页问题探讨问题探讨手术刀缝合针运输工具培育抗虫棉培育抗虫棉需要哪些基需要哪些基本工具本工具? ?第2页/共46页第3页/共46页问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉第4页/共46页普通棉花普通棉花( (无抗虫特性无抗虫特性) )苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取抗虫基因抗虫基因棉花细胞棉花细胞( (含抗虫基因含抗虫基因) )棉花植株棉花植株( (有抗虫特性有抗虫特性) )上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？上述培育抗虫

2、棉的关键步骤是什么？重组重组DNADNA导入导入形成形成基因工程培育抗虫棉的简要过程基因工程培育抗虫棉的简要过程第5页/共46页基因工程培育抗虫棉的关键步骤基因工程培育抗虫棉的关键步骤关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来细胞内提取出来关键步骤二：关键步骤二：形成重组形成重组DNADNA关键步骤三：关键步骤三：重组重组DNADNA导入受体导入受体( (棉花棉花) )细胞细胞第6页/共46页1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来细胞内提取出来关键步骤二

3、：关键步骤二：形成重组形成重组DNADNA关键步骤三：关键步骤三：重组重组DNADNA导入受体导入受体( (棉花棉花) )细胞细胞第7页/共46页主要来源：主要来源：2.种类与命名：种类与命名：3.作用：作用：4.作用结果：作用结果：主要是从主要是从原核生物原核生物中分离纯化出来中分离纯化出来的一类酶。的一类酶。约约4000种种识别特定的核苷酸序列，断裂磷酸二酯键识别特定的核苷酸序列，断裂磷酸二酯键。形成粘性末端或平末端形成粘性末端或平末端第8页/共46页来源来源种类种类特点特点作用作用结果结果阅读课本4-5页“限制性核酸内切酶分子手术刀”的相关内容，填写下表自主学习自主学习主要从原核生物中分

4、离纯化而来已经分离出大约4000种1、识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列2、使每一条链中使每一条链中特定部位特定部位的两个核的两个核苷酸之间的苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。第9页/共46页12345脱氧核苷酸的结构脱氧核苷酸的结构第10页/共46页 G1234512345 A3,5-磷磷酸二酯酸二酯键键3端5端3端5端磷酸二酯键磷酸二酯键第11页/共46页12仔细观察各限制酶仔细观察各限制酶 识别的特定序列有识别的特定序列有何何 特点？特点？限制酶的识别序列限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两

5、侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列第12页/共46页能被限制性内切酶特能被限制性内切酶特异性识别的切割部位异性识别的切割部位都具有都具有回文序列回文序列：在切割部位，一条链在切割部位，一条链正向正向读的碱基顺序与读的碱基顺序与另一条链另一条链反向反向读的顺读的顺序完全序完全一致一致。第13页/共46页中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。EcoRIEcoRI限制酶的作用限制酶的作用第14页/共46页黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA

6、两条两条单链的切口，带有几个单链的切口，带有几个伸出的伸出的核苷酸核苷酸，他们之间正好互补配他们之间正好互补配对，这样的切口叫对，这样的切口叫黏性末端黏性末端。第15页/共46页SmaISmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线SmaISmaI限制酶的作用限制酶的作用在G与C之间切割第16页/共46页SmaISmaI限制酶的切限制酶的切割割当限制酶当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，从识别序列的中心轴线处切开时，切开的切开的DNADNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端平末端。第17页/共46页以下是两种限制酶切割后形成的以下

7、是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：片段，试分析：GC AATTC GC CTTAA CG G CG G (1)其中和其中和 是由一种限制酶切割形成的是由一种限制酶切割形成的 末端，所用末端，所用限制酶限制酶是是 。 （2） 和和 是由另一种限制酶切割形成的是由另一种限制酶切割形成的 末端，所用的末端，所用的限制酶限制酶可以是可以是 。反馈练习反馈练习SmaI限制酶EcoRI限制酶第18页/共46页在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ）A.同种限制酶 B. 两种限制酶C. 同种连接酶 D. 两种连接酶反馈练习反馈练习第19页/共46页你能推测限制酶存在于原核生

8、物中的你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？作用是什么吗？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵，的入侵，但生物但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。制，以防止外来病原物的侵害。限制酶限制酶就是细就是细菌的一种菌的一种防御性工具，防御性工具，当外源当外源DNA侵入时，会侵入时，会利用限制酶利用限制酶将外源将外源DNA切割掉，切割掉，以保证自身的以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源割外源DNA、使之失效，使之失效，从而达到从而达到保护

9、自身保护自身的的目的。目的。寻根问底寻根问底第20页/共46页寻根问底寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其的细胞，其DNADNA分子中分子中不具备这种限制酶不具备这种限制酶的识别切割序列的识别切割序列，或者，或者通过甲基化酶将甲通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的种限制酶也不会使自身的DNADNA被切断，并被切断，并且可以防止外源且可以防止外源DNADNA的入侵

10、。的入侵。 第21页/共46页类型来源功能相同点差别EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)阅读课本第5页“分子缝合针”DNA连接酶的相关内容，填写下表自主学习自主学习第22页/共46页把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯键DNADNA连接酶的作用连接酶的作用第23页/共46页两两DNADNA片段要具有片段要具有互补互补的黏性末端的黏性末端才能拼起来才能拼起来DNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来起来，注意

11、：注意：DNADNA连接酶可连接双链连接酶可连接双链DNADNA中的两条单链缺口，中的两条单链缺口，但不能连接单链但不能连接单链DNADNA！第24页/共46页DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗？聚合酶是一回事吗？T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低DNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用第25页/共46页ATGCATGC DNA DNA聚合酶连接单链聚合酶连接单链DNADNA把单个脱氧核苷酸连接到把单个脱氧核苷酸连接到DNADNA片段上片段上DNA聚聚合合酶酶DNA聚聚合合酶酶DNA聚聚合合酶酶第26页/共46页DNA连接酶连接酶DNA聚

12、合酶聚合酶相相同同点点作用实质作用实质化学本质化学本质不不同同点点模板模板作用对象作用对象 作用结果作用结果用途用途都能催化形成都能催化形成磷酸二酯键磷酸二酯键都是蛋白质都是蛋白质不需要不需要需要需要DNA的一条的一条链作为模板链作为模板形成完整的重形成完整的重组组DNA分子分子形成形成DNA的一条的一条链链基因工程基因工程DNA复制复制DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶的比较聚合酶的比较只能将只能将单个核苷单个核苷酸酸连接到已有的连接到已有的DNADNA片段上，形片段上，形成磷酸二酯键成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键第27页/共46页小试身手小试身手 DNADNA连接酶催化的反

13、应是（连接酶催化的反应是（ ）A A、DNADNA复制时母链与子链之间形成氢键复制时母链与子链之间形成氢键B B、黏性末端碱基之间形成氢键、黏性末端碱基之间形成氢键C C、两个、两个DNADNA片断黏性末端之间的缝隙的片断黏性末端之间的缝隙的连接连接D D、A A、B B、C C都不正确都不正确c c第28页/共46页以下是两种限制酶切割后形成的以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：片段，试分析：GC AATTC GC CTTAA CG G CG G (1)其中和其中和 是由一种限制酶切割形成的是由一种限制酶切割形成的 末端，两者要重组成一个末端，两者要重组成一个DNA 分子，所用分

14、子，所用DNA连接连接酶通常是酶通常是 。 （2） 和和 是由另一种限制酶切割形成的是由另一种限制酶切割形成的 末端，两者要形成重组末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常片段，所用的连接酶通常是是 。反馈练习反馈练习T4 DNA连接酶Ecoli DNA连接酶和T4 DNA连接酶第29页/共46页限制酶与限制酶与DNADNA解旋酶、解旋酶、DNADNA水解酶的比较水解酶的比较第30页/共46页 比较比较第31页/共46页载体的载体的作用作用载体的必要条件载体的载体的种类种类阅读课本第6页“分子运输车分子运输车”载体载体的相关内容，填写下表自主学习自主学习细菌的质粒细菌的质粒病毒：病毒：

15、、动植物病毒等。、动植物病毒等。 第32页/共46页有标记基因的存有标记基因的存在，可用含青霉在，可用含青霉素的培养基鉴别。素的培养基鉴别。有切割位点有切割位点能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制质粒质粒裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核核DNA）之外，并具有）之外，并具有自我复制能力自我复制能力的很小的双链环状的很小的双链环状DNA分子。对分子。对主要存在于主要存在于其中最常用的是其中最常用的是最常用运载体最常用运载体质粒质粒 实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造

16、的。第33页/共46页（双选）关于质粒的叙述正确的（双选）关于质粒的叙述正确的A. A. 质粒是能够自我复制的环状质粒是能够自我复制的环状DNADNA分分子子 B. B. 质粒是基因工程常用的载体质粒是基因工程常用的载体C. C. 重组质粒是目的基因重组质粒是目的基因D. D. 质粒可在宿主外单独复制质粒可在宿主外单独复制ABAB反馈练习反馈练习第34页/共46页小结升华小结升华限制酶限制酶DNADNA连接酶连接酶载体载体来源来源特点特点结果结果作用作用种类种类特点特点种类种类条件条件作用作用DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具第35页/共46页课本知识回顾 基因工程又叫做基因工程又叫做

17、 或或 。通俗地说，就是。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某按照人们的意愿，把一种生物的某 种种 提取出来，加提取出来，加以以 ， 然后放到另一种生物的细胞里，然后放到另一种生物的细胞里， 改造生物的遗传性状。改造生物的遗传性状。基因拼接技术DNA重组技术基因修饰改造定向地第36页/共46页DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具“分子手术刀” “分子缝合针” “分子运输车”限制（性核酸内切）酶DNA连接酶载体第37页/共46页原核生物中分离纯化出来特定的核苷酸序列磷酸二酯键粘性末端平末端第38页/共46页1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：两类两类连接黏性末端连接黏性末

18、端Ecoli DNA连接酶T4 DNA连接酶磷酸二酯键连接黏性末端和平末端连接黏性末端和平末端第39页/共46页通常有三种:作为载体的条件： 在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在 质粒噬菌体衍生物动植物病毒天然质粒人工改造的能自我复制；有切割位点；能自我复制；有切割位点；有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离基础上进行过第40页/共46页在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ）A.同种限制酶 B. 两种限制酶C. 同种连接酶 D. 两种连接酶第41页/共46页第42页/共46页下列关于限制酶和下列关于限制酶和DNADNA连接酶的理解正确的是连接酶的理解正确的是A A、其化学本质都是蛋白质、其化学本质都是蛋白质B B、DNADNA连接酶可以恢复连接酶可以恢复DNADNA中的氢键中的氢键C C、在基因工程操作中可以用、在基因工程操作中可以用DNADNA聚合酶代替聚合酶代