12基因工程的原理和技术75

1、第二节第二节 基因工程的原理和技术基因工程的原理和技术 基因工程的原理：基因工程的原理： 基因重组基因重组 基因工程的目标：基因工程的目标： 让人们感兴趣的基因在宿主细让人们感兴趣的基因在宿主细胞中稳定和高效表达。胞中稳定和高效表达。1）获得目的基因；）获得目的基因；2）形成重组）形成重组DNA分子；分子；3）将重组）将重组DNA分子导入受体细胞；分子导入受体细胞；4）筛选含有目的基因的受体细胞；）筛选含有目的基因的受体细胞；5）目的基因的表达。目的基因的表达。步骤步骤1：获得目的基因获得目的基因目的基因：是人们所需要转移或改造的基因目的基因：是人们所需要转移或改造的基因 如人的胰岛素基因、干

2、扰素基因、白细如人的胰岛素基因、干扰素基因、白细胞介素基因、植物的抗病基因、抗虫基因、胞介素基因、植物的抗病基因、抗虫基因、抗除草剂基因、种子贮藏蛋白的基因等。抗除草剂基因、种子贮藏蛋白的基因等。获得目的基因的方法：获得目的基因的方法：已知序列已知序列未知序列未知序列化学方法合成化学方法合成利用利用PCR技术扩增技术扩增从基因文库获得从基因文库获得1 1）人工合成）人工合成 已知其序列已知其序列 已知其已知其mRNA mRNA 的序列的序列 已知其翻译产物的氨基酸序列已知其翻译产物的氨基酸序列2）聚合酶链式反应）聚合酶链式反应即即PCR技术技术氢键断裂，形成单链氢键断裂，形成单链DNADNA。

3、引物与引物与DNADNA模板结合，模板结合，形成局部双链。形成局部双链。 在酶的作用下，不断延在酶的作用下，不断延伸，合成双链伸，合成双链DNADNA。多次循环，获得大量多次循环，获得大量双链双链DNADNA分子。分子。uPCRPCR技术扩增技术扩增基因文库：基因文库：用重组用重组DNADNA技术将某种生物细胞的总技术将某种生物细胞的总DNADNA或或染色体染色体DNADNA的所有片断随机地连接到基因载体上，然后的所有片断随机地连接到基因载体上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系片段的无性繁殖系( (克隆克隆) )，

4、在制备的克隆数目多到可，在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。同一定组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。同一定义也适用于某种生物的线粒体义也适用于某种生物的线粒体DNADNA或叶绿体或叶绿体DNADNA的基因的基因文库。文库。 基因库基因库是指某一生物群体中的全部基因。是指某一生物群体中的全部基因。基因克隆基因克隆是只包含某些特定基因或是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。片段的克隆。基因文库基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时中包含着为数众多的克隆，建成后可供随

5、时选取其中任何一个基因克隆之用。选取其中任何一个基因克隆之用。基因文库基因文库: : 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段片段, ,导入导入受体菌的群体中储存受体菌的群体中储存, ,各个受体菌分别含有这种生物的各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因不同的基因, ,称为基因文库称为基因文库(gene library)(gene library)基因组文库基因组文库: : 基因文库中包含了一种生物所有的基因基因文库中包含了一种生物所有的基因, ,这种基这种基因文库叫做基因组文库因文库叫做基因组文库. .部分基因文库部分基因文库: : 基因文库中包含了一种生物的一

6、部分基因基因文库中包含了一种生物的一部分基因, ,这种基这种基因文库叫做部分基因文库因文库叫做部分基因文库. .步骤步骤2 2、重组、重组DNADNA分子的形成：分子的形成：质粒质粒DNADNA分子分子同种限制酶同种限制酶一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）GAATTCCGTAGAATTCGGATT CTTCATGAATTCCCTAA GAAGTACTTAAGGGATT CTTAAGGCATCTTAAGCCTAA CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA

7、GGGATT GGCATCTTAAAATTCCGTAG 思考：思考： 目的基因、运载体质粒经目的基因、运载体质粒经DNADNA连接酶处连接酶处理，可能有几种产物？理，可能有几种产物？1 1、目的基因与目的基因结合；、目的基因与目的基因结合；2 2、质粒与质粒结合；、质粒与质粒结合；3 3、目的基因与质粒结合。、目的基因与质粒结合。(08海南海南) 图为某种质粒表达载体图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性简图，小箭头所指分别为限制性内切酶内切酶EcoRI、BamHI的酶切位的酶切位点，点，ampR为青霉素抗性基因，为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，为四环素抗性基因，P为启为

8、启动因子，动因子，T为终止子，为终止子，ori为复制为复制原点。已知目的基因的两端分别原点。已知目的基因的两端分别有包括有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。在内的多种酶的酶切位点。（1）将含有目的基因的）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中连接酶进行连接后，其中由两个由两个DNA片段之间连接形成的产物有片段之间连接形成的产物有 三种。三种。目的基因载体连接物 载体-载体连接物 目的基因-目的基因连接物 （2）用上述）用上述3种连接产物与种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞无任何抗药

9、性的原核宿主细胞接种到含四环的培养基中，能接种到含四环的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是连接产物是（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶时的酶时 。载体-载体连接物；目的基因-载体连接、载体-载体连接物 EcoRI和BamHI （1）常用的受体细胞：）常用的受体细胞：大肠杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、酵母菌、动植物细胞等。动植物细胞等。步骤步骤3 3、将目的基因导入受

10、体细胞、将目的基因导入受体细胞（2 2）导入方法：）导入方法：（3 3）导入过程：）导入过程：受体细胞：细菌受体细胞：细菌CaCL2细胞壁的通透性增大细胞壁的通透性增大重组质粒进入受体细胞重组质粒进入受体细胞目的基因随受体细胞的繁殖而复制目的基因随受体细胞的繁殖而复制将目的基因导将目的基因导入受体细胞入受体细胞将受体细胞将受体细胞进行扩增进行扩增借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术（最多、最有效）（最多、最有

11、效）3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理，处理，以增加细菌细胞壁的通透性。以增加细菌细胞壁的通透性。直接导入法：电击、显微注射、直接吸收、基因直接导入法：电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。枪等方法。（1 1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。（2 2）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。因注入宿主细胞。（3 3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。

12、收。（4 4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。宿主细胞中。间接导入法：常用的载体是质粒、间接导入法：常用的载体是质粒、 噬菌体。噬菌体。（1 1）质粒是细菌染色体）质粒是细菌染色体DNADNA以外的环状双链以外的环状双链DNADNA分子，它分子，它能自我复制，也可整合到细胞染色体能自我复制，也可整合到细胞染色体DNADNA中与其一起表达。中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。质粒通常还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。（2 2） 噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链噬菌体是一种细

13、菌病毒，其环状双链DNADNA可以作为目可以作为目的基因的载体。的基因的载体。采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是：的基因的做法正确的是：( )( )将毒素蛋白注射到棉受精卵中将毒素蛋白注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，注射到棉受精序列，注射到棉受精卵中卵中将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，与质粒重组，序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养行组织培养将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，与细菌质粒重序列，

14、与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵组，注射到棉的子房并进入受精卵 A.A. B. B. C . C . D. D.步骤步骤4 4、筛选含有目的基因的受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞抗抗四环素基因四环素基因重组重组DNA步骤步骤5 5、目的基因的表达、目的基因的表达1 1、特定性状的产生与否；、特定性状的产生与否；2 2、是否产生特定的产物。、是否产生特定的产物。2 2利用外源基因在受体细胞中表达，可生产利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是（因完成了在受体细胞中表达的是（ ）

15、A A棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B B大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAmRNAC C山羊乳腺细胞中检测到人生长激素山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNADNA序列序列D D酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白D思考：思考： 干扰素是一种抗病毒药物，其化学本干扰素是一种抗病毒药物，其化学本 质是蛋白质，假如现在要用大肠杆菌质是蛋白质，假如现在要用大肠杆菌 来生产抗病毒干扰素，如何操作？来生产抗病毒干扰素，如何操作？载体质粒载体质粒外源外源DNADNA片段片段外源外源DNADNA插入插入剪

16、切剪切引入宿主细胞引入宿主细胞选出含有重组选出含有重组DNADNA的细胞扩增的细胞扩增A 从人的淋巴细胞中提取从人的淋巴细胞中提取干扰素基因，转移到大肠干扰素基因，转移到大肠杆菌质粒中，再导入到其杆菌质粒中，再导入到其体内。体内。(画图讲解画图讲解)1 1 用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是白质。下列叙述不正确的是 A A常用相同的限制性内切酶处理的基因常用相同的限制性内切酶处理的基因 和质粒和质粒 B BDNADNA连接酶和连接酶和 RNARNA聚合酶是构建重组质粒聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶必需的工具酶 C C可用含抗生素的

17、培养基检测大肠杆菌中可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒是否导入了重组质粒 D D导入大肠杆菌的目的基因不一定能导入大肠杆菌的目的基因不一定能 成功表达成功表达 B B巩固练习巩固练习D1.1.有关基因工程的叙述中，错误的是有关基因工程的叙述中，错误的是 （ ） A A、DNADNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B B、限制性核酸内切酶用于目的基因的获得、限制性核酸内切酶用于目的基因的获得 C C、目的基因须由载体导入受体细胞、目的基因须由载体导入受体细胞 D D、人工合成目的基因不用限制性内切酶、人工合成目的基因不用限制性内切酶A 6 6、将、将adaada（腺苷酸脱氨酶基因）通过质粒（腺苷酸脱氨酶基因）通过质粒pET28bpET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是述错误的是 A. A. 每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒 B. B. 每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶每个重组质粒至少含一个限制性核